李秀霞，劉孝芳，王 珍，孫協(xié)軍，羅巧玲

(1. 渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 錦州 121013; 2. 遼寧華鴻檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司， 遼寧 錦州 121013)

0 引言

孔雀石綠(Malachite green，MG)是一種三苯甲烷類化合物，在水生物體中的主要代謝產(chǎn)物是隱性孔雀石綠(LMG)，孔雀石綠和隱性孔雀石綠的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1所示，隱性孔雀石綠不溶于水，殘留毒性比孔雀石綠更強(qiáng).孔雀石綠一直作為重要的工業(yè)原料和治療水產(chǎn)動(dòng)物水霉病的有效藥物，但由于孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物-隱性孔雀石綠的高毒性、高殘留和致畸、致癌、致突變作用.在我國(guó)，禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中將孔雀石綠作為消毒劑使用〔1〕，但近年來(lái)，在鮮活魚(yú)蝦藥物殘留的檢測(cè)中，孔雀石綠時(shí)有檢出〔2,3〕，水體的污染是孔雀石綠檢出的主要原因之一，因此，研究水體中痕量孔雀石綠殘留的檢測(cè)方法是必要的.

圖1 孔雀石綠(MG)和隱性孔雀石綠(LMG)的結(jié)構(gòu)式

水體中孔雀石綠經(jīng)提取和凈化后，采用光譜或色譜儀器檢測(cè)〔4,5〕.隱性孔雀石綠的最大吸收波長(zhǎng)為267 nm，背景干擾嚴(yán)重，因此，傳統(tǒng)的液相色譜檢測(cè)方法中采用二氧化鉛柱后氧化法將隱性孔雀石綠氧化為孔雀石綠進(jìn)行檢測(cè)〔6〕.桂英愛(ài)等〔7〕采用乙腈和二氯甲烷混合溶劑多次萃取海水中孔雀石綠，二氧化鉛柱后氧化法測(cè)定，但柱后氧化法對(duì)pH要求嚴(yán)格，操作難度高，且存在隱性孔雀石綠被分解的危險(xiǎn)〔8〕，此方法逐漸被液相色譜-熒光法〔9〕、拉曼光譜法〔10〕，液相色譜-質(zhì)譜法〔11〕，甚至超高壓液相色譜法〔12〕等新型檢測(cè)方法取代.隨著檢測(cè)方法的發(fā)展，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者對(duì)于水體孔雀石綠的提取及凈化方法也進(jìn)行了改進(jìn)研究.液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法所需樣品前處理方法簡(jiǎn)單，但儀器成本昂貴.相比于水產(chǎn)品，養(yǎng)殖水體中孔雀石綠殘留檢測(cè)的前處理方法簡(jiǎn)單得多〔13〕，馮敏鈴等〔14〕對(duì)養(yǎng)殖水中孔雀石綠提取凈化時(shí)是否采用固相萃取柱進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)前處理不過(guò)任何萃取小柱凈化，回收率也有70%，但考慮到復(fù)雜水體中各類雜質(zhì)的影響，作者建議提取液經(jīng)過(guò)凈化處理.但由于其殘留量很低，如何避免孔雀石綠在前處理中損失是建立水體孔雀石綠殘留檢測(cè)的關(guān)鍵.基于這一研究前提，本實(shí)驗(yàn)在已有研究的基礎(chǔ)上，建立簡(jiǎn)單、可靠且回收率高的水體中孔雀石綠及其殘留檢測(cè)的液相色譜/熒光檢測(cè)方法.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

孔雀石綠草酸鹽(純度>98%，北京保樂(lè)吉生物科技有限公司)，PRS柱(美國(guó)賽分科技有限公司，500 mg/6 mL).DG-12B型固相萃取裝置(上海皓莊儀器有限公司)；1260液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；KQ500E超聲波清洗器(上海舒美超聲波儀器有限公司).

1.2 樣品的提取與凈化

1.2.1 提取

準(zhǔn)確量取20 mL待測(cè)池塘養(yǎng)殖水樣于離心管中，分別加入2 mL提取液(含對(duì)甲苯磺酸0.024 mg/mL，鹽酸羥胺0.3 mg/mL)和10 mL有機(jī)溶劑，5 μg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，1 mL二甘醇溶液，劇烈振搖后，靜止10 min，收集下層溶液于梨形瓶中，上層液體再重復(fù)萃取1次，合并有機(jī)溶劑層，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，向梨形瓶中加入2 mL乙腈和1 mL1%硼氫化鉀溶液，旋渦混合2 min，備用.

1.2.2 凈化

先用5 mL乙腈分兩次活化PRS柱，將梨形瓶中溶液上樣，將1.2.1中所得溶液過(guò)PRS柱，將PRS柱抽至近干，用3 mL pH 4.9的乙腈-0.1mol/L乙酸銨溶液(1:1，v/v)洗脫，接收于5 mL刻度管中，定容至3 mL，最后用0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用.

1.2.3 色譜分析

具體色譜分析條件參照李秀霞(2016)〔15〕報(bào)道，采用XB-C18色譜柱分離后，熒光檢測(cè)器檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2是濃度為0.5 mg/L孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖，由圖2可知，孔雀石綠出峰時(shí)間為14.408 min.圖2中目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰峰形尖銳且對(duì)稱、附近無(wú)干擾峰，分離效果良好.孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程為y=195.32x-0.75，線性范圍為0.002～1.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)r2=0.9999，線性擬合良好.

2.2 提取劑的選擇

GB/T19857-2005在水產(chǎn)品孔雀石綠殘留的提取過(guò)程中加入了對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺兩種試劑，其中對(duì)甲苯磺酸酸性很強(qiáng)，作為離子對(duì)試劑，增加孔雀石綠在有機(jī)溶劑中的溶解能力，而鹽酸羥胺作為還原劑，可防止孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的氧化降解.馮敏鈴等〔14〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，是否加入鹽酸羥胺和對(duì)甲苯磺酸對(duì)水體中孔雀石綠回收率的影響不大，而桂英愛(ài)等〔7〕和馬瑞欣等〔13〕都是直接采用二氯甲烷和乙腈的混合有機(jī)溶劑提取水體中孔雀石綠和隱性孔雀石綠，在未加入對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺的條件下，取得很好的回收率.作者在前期實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，加入鹽酸羥胺對(duì)雜質(zhì)較少的自來(lái)水中孔雀石綠加標(biāo)回收率影響不大，而對(duì)增氧的魚(yú)缸水中孔雀石綠回收率的影響較大.因此，在1.2.1所述提取方法基礎(chǔ)上，對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺提取劑和有機(jī)溶劑的體積不變，考查是否加入對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺及不同有機(jī)溶劑對(duì)孔雀石綠回收率的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果如表1所示.從表1可以看出，以二氯甲烷為提取溶劑時(shí)，是否加入對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺對(duì)孔雀石綠的回收率影響不大，而用乙腈做提取劑時(shí)，不加入對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺顯著降低了孔雀石綠的回收率(p<0.05)，這可能與乙腈的極性相對(duì)較高有關(guān)，離子對(duì)試劑的加入增加孔雀石綠在乙腈中的溶解能力，而采用乙腈或乙腈/二氯甲烷(1:1, v/v)作為提取溶劑時(shí)，溶液不易分層，因此在分液漏斗中加入了1 mL二甘醇溶液.由于本實(shí)驗(yàn)水體雜質(zhì)較多，呈綠色，為保持其中孔雀石綠等藥物殘留在運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定性，采取加入對(duì)甲苯磺酸和鹽酸羥胺提取劑，同時(shí)采用乙腈/二氯甲烷(1:1, v/v)作為提取溶劑提取水體中孔雀石綠.

圖2 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

表1 不同提取劑和提取溶劑對(duì)孔雀石綠回收率的影響

2.3 凈化方法的選擇

在已有的水體孔雀石綠凈化方法中，多使用PRS、MCX、中性氧化鋁小柱等作為固相萃取小柱使用，孔雀石綠的回收率在70%以上，經(jīng)固相萃取柱凈化后，樣品純度基本能滿足液相色譜-熒光檢測(cè)法的要求〔14,15〕.氧化鋁小柱可吸附油溶性雜質(zhì)，而中性氧化鋁柱凈化后孔雀石綠的回收率不高〔16〕，PRS、MCX、酸性氧化鋁小柱凈化后的孔雀石綠回收率均超過(guò)70%，而未經(jīng)任何固相萃取小柱凈化的孔雀石綠回收率也在70%以上〔7,13〕.在2.2優(yōu)化出的提取方法的基礎(chǔ)上，采用1.2.2方法對(duì)樣品進(jìn)行了凈化處理，孔雀石綠的加標(biāo)回收率為77.8%(見(jiàn)表1).不經(jīng)過(guò)PRS柱凈化的處理組中，直接將梨形瓶中的3 mL溶液用0.45 μm膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)，得到孔雀石綠的回收率為78.11%，比經(jīng)固相萃取后的樣品略有提高，但差異不顯著(p>0.05).鑒于復(fù)雜水體中藻類、淤泥等復(fù)雜基質(zhì)的影響，實(shí)驗(yàn)室中用于檢測(cè)孔雀石綠的色譜柱在使用五六個(gè)月后柱效就明顯降低，在不經(jīng)過(guò)固相萃取凈化的情況下，大約三個(gè)月左右色譜柱柱效就明顯降低，因此，如果是檢測(cè)池塘水等復(fù)雜水體，還是需要對(duì)樣品進(jìn)行必要的固相萃取凈化處理，而如果是地下水、自來(lái)水等較干凈的水樣，可不經(jīng)過(guò)固相萃取凈化直接進(jìn)樣.

2.4 孔雀石綠檢出限和回收率的測(cè)定

參照2.3和2.4優(yōu)化出的樣品前處理方法，準(zhǔn)確量取20 mL待測(cè)池塘養(yǎng)殖水樣于離心管中，分別加入2 mL提取液(含對(duì)甲苯磺酸0.024 mg/mL，鹽酸羥胺0.3 mg/mL)和10 mL有機(jī)溶劑(1:1乙腈/二氯甲烷溶液，v/v)，10 mL不同濃度的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 mL二甘醇溶液，以下按照1.2.1和1.2.2方法提取和凈化，分別按照三倍信噪比和十倍信噪比測(cè)量最低檢出限和定量限，分別為2.0 μg/L和 5.0 μg/L，檢出限和定量限符合要求.

加標(biāo)后水樣的色譜圖見(jiàn)圖3，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2.3個(gè)添加水平的孔雀石綠平均加標(biāo)回收率為72.3%～83.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.36%～6.15%之間，所述方法可用于池塘水中孔雀石綠的檢測(cè).

圖3 加標(biāo)魚(yú)樣的液相色譜-熒光檢測(cè)圖譜

表2 孔雀石綠加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

采用乙腈/二氯甲烷(1:1, v/v)提取和PRS柱凈化后液相色譜-熒光法檢測(cè)養(yǎng)殖淡水中孔雀石綠殘留，孔雀石綠在0.002-1.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999，最低檢出限和定量限分別為2.0 μg/L和5.0 μg/L.平均加標(biāo)回收率為72.3%～83.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.36%～6.15%之間，該方法靈敏度高，適于養(yǎng)殖水體中孔雀石綠殘留的分析檢測(cè).