L-8900氨基酸分析儀檢測不同形態(tài)保健食品中?；撬岷?/h1>
2019-12-12 01:34:06嚴(yán)俊徐柏楊顏琳琦程巧鴛周明昊
食品工業(yè) 2019年11期
嚴(yán)俊，徐柏楊，顏琳琦，程巧鴛，周明昊*
浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院（杭州 310052）
?；撬幔═aurine）又稱β-氨基乙磺酸[1]，是一種含硫的非蛋白氨基酸，主要以游離狀態(tài)存在于組織間液和細(xì)胞內(nèi)液中，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成[2]。但其作為體內(nèi)的一種重要生理活性物質(zhì)，參與體內(nèi)一系列生理學(xué)過程，如神經(jīng)元調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜通道調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化[3-7]，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗疲勞、改善視功能和抗氧化等生理功能[8-10]。目前?；撬岬膽?yīng)用已由最初的藥用為主，轉(zhuǎn)向以食品添加劑和營養(yǎng)保健品為主，已被廣泛用于各類保健食品中，成為普遍、大眾化的消費(fèi)品。
目前牛磺酸檢測方法有很多，如薄層色譜法[11]、高效液相色譜法[12-13]、液質(zhì)聯(lián)用法[14]、電位滴定法[15]、離子色譜法[16]等。這些方法缺點(diǎn)在于前處理操作繁瑣、耗時(shí)，影響因素較多，所需設(shè)備條件要求較高。而國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中?；撬岬臏y定》是現(xiàn)行檢測保健食品中?；撬嶂饕姆ǘ?biāo)準(zhǔn)[17]，其第一法為鄰苯二甲醛（OPA）柱后衍生高效液相色譜法；第二法為丹磺酰氯柱前衍生法，用紫外或熒光檢測器檢測。兩法樣品前處理繁雜耗時(shí)，OPA毒性較大，丹磺酰氯對光和濕敏感不穩(wěn)定，且衍生時(shí)間需2 h。
因此試驗(yàn)建立了全自動(dòng)氨基酸分析儀測定不同形態(tài)保健食品中?；撬岬暮?。樣品經(jīng)水超聲提取后，再經(jīng)離子交換柱層析分離，被分離出的?；撬嵬ㄟ^柱后與茚三酮溶液反應(yīng)顯色，在570 nm處通過外標(biāo)法定量檢測。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；茚三酮顯色溶液套裝（和光純藥株式會(huì)社）；氨基酸分析儀配套緩沖溶液（三菱化學(xué)株式會(huì)社）；?；撬釋φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號(hào)：111616-201605，含量100%）。
1.2 儀器與設(shè)備
L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀（日立Hitachi公司）；XPE205電子天平（瑞士梅特勒）；P300H超聲波清洗器（德國ELMA公司）；超純水儀（美國密理博公司）。
1.3 試驗(yàn)條件
離子交換柱：4.6 mm×60.0 mm（填料為離子交換樹脂，日立2622）；反應(yīng)柱：不銹鋼柱4.6 mm× 40.0 mm（填料為石英砂，日立855-3523）。交換柱柱溫57 ℃，反應(yīng)柱柱溫135 ℃，緩沖液流速0.4 mL·min-1，茚三酮流速0.35 mL·min-1。檢測波長570 nm，循環(huán)時(shí)間20 min，采集時(shí)間10 min，進(jìn)樣量20 μL。
1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 對照品溶液的制備
精密稱取57.85 mg對照品，置50 mL容量瓶中，加適量水，超聲5 min使其溶解，用水定容至刻度，得對照品儲(chǔ)備液。
1.4.2 供試品溶液的制備
1.4.2.1 液體樣品
取樣品混勻，取約1.0 mL（0.1～5 mL）樣品置50 mL容量瓶中，加適量水，超聲提取20 min，稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜即得。
1.4.2.2 固體樣品
取固體樣品置研缽中研細(xì)混勻，稱取約1.0 g（0.1～ 5 g）樣品置50 mL容量瓶中，加適量水，超聲提取20 min，稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜即得。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品前處理的優(yōu)化
試驗(yàn)以固體和液體2種不同形態(tài)的樣品作為供試品，分別考察以純水和0.02 mol/L HCl溶液作為溶劑的提取效果，并同時(shí)對超聲時(shí)間（15，20和25 min）進(jìn)行比較。結(jié)果表明，純水和0.02 mol/L HCl兩種溶劑對不同形態(tài)樣品中?；撬崽崛⌒Ч^好，超聲時(shí)間20 min能將?；撬崽崛⊥耆?。因此從能耗環(huán)保等方面綜合考慮，選擇純水作為提取溶劑，超聲時(shí)間為20 min。
2.2 線性關(guān)系考察
精密移取適量對照品儲(chǔ)備液，用水稀釋制成質(zhì)量濃度為5.79，11.57，23.14，46.28和115.70 μg·mL-1的系列溶液，進(jìn)樣量為20 μL。測定色譜峰面積，以?；撬釢舛龋╔，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，?；撬岱迕娣e（Y，mV）為縱坐標(biāo)，求得回歸方程Y=219 093X+59 387（r=1.000 0）。表明?；撬嵩?.79～115.70 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，色譜圖見圖1。
2.3 儀器精密度試驗(yàn)
精密吸取對照品溶液（46.28 μg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣6次，?；撬岱迕娣eRSD為0.29%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.4 重復(fù)性試驗(yàn)
按照2.3項(xiàng)下方法，制備兩種不同形態(tài)樣品，各6份，計(jì)算其中?；撬岷考癛SD（n=6）。固體制劑?；撬岷繛?1 243 mg·kg-1，RSD為0.39%；液體制劑?；撬岷繛? 045 mg·kg-1，RSD為0.42%，表明方法重復(fù)性良好。
2.5 定量限和檢測限
以牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜響應(yīng)值計(jì)算，當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，測得儀器的檢出限為0.064 μg·mL-1，換算得到方法的檢測限為3.2 mg·kg-1；當(dāng)信噪比（S/N）為10時(shí)，測得儀器的定量為0.214 μg·mL-1，方法的定量限為10.7 mg·kg-1。
2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別取同一份固體樣品和液體樣品，在0，2，7.5，13，24和48 h重復(fù)進(jìn)樣，記錄樣品中?；撬岬姆迕娣e，測得峰面積RSD分別為0.52%和0.68%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)
取已知含量的固體樣品和液體樣品，各9份，其中固體樣品每份約0.05 g，液體樣品每份0.5 mL，分別加入0.1，1.0和2.5 mL對照品儲(chǔ)備液，按照2.3項(xiàng)下方法提取、制備，分別作為低、中、高濃度供試品溶液，每個(gè)濃度平行3份，每份平行測定6次，其中固體樣品進(jìn)樣量為10 μL，液體樣品進(jìn)樣量為20 μL，按2.1項(xiàng)下測定結(jié)果，平均回收率為98.59%～100.78%，RSD為0.33%～1.90%（n=6）。結(jié)果見表1。
2.8 專屬性試驗(yàn)
將樣品溶液與17種氨基酸混合對照品溶液制成適合濃度的混度溶液，通過氨基酸分析儀進(jìn)行分析。通過試驗(yàn)可知，樣品中?；撬崤c17種氨基酸出峰互不干擾，實(shí)現(xiàn)基線分離，可以與17種氨基酸同時(shí)測定，結(jié)果見圖2。
圖1 樣品與對照品色譜圖
表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）
圖2 樣品中牛磺酸與17種氨基酸色譜圖
2.9 樣品測定
抽取近期抽樣檢測收集的含?；撬岬谋＝∈称?，共7批。按照2.3項(xiàng)下制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下測定，結(jié)果見表2。
表2 樣品含量測試結(jié)果（n=2）
3 結(jié)論
該研究成功建立了一種基于L-8900氨基酸分析儀檢測不同形態(tài)保健食品中?；撬岬臋z測方法。在試驗(yàn)條件下，該法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析時(shí)間短、樣品前處理簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、不需要衍生化試劑，減少人工衍生帶來的偶然誤差。此外，該法可以實(shí)現(xiàn)?；撬崤c常規(guī)17種氨基酸的同時(shí)測定，互不干擾。該試驗(yàn)結(jié)果豐富了保健食品中牛磺酸含量檢測的相關(guān)研究，為進(jìn)一步研究和制定保健食品中牛磺酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持。
嚴(yán)俊，徐柏楊，顏琳琦，程巧鴛，周明昊*
浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院（杭州 310052）
?；撬幔═aurine）又稱β-氨基乙磺酸[1]，是一種含硫的非蛋白氨基酸，主要以游離狀態(tài)存在于組織間液和細(xì)胞內(nèi)液中，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成[2]。但其作為體內(nèi)的一種重要生理活性物質(zhì)，參與體內(nèi)一系列生理學(xué)過程，如神經(jīng)元調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜通道調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化[3-7]，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗疲勞、改善視功能和抗氧化等生理功能[8-10]。目前?；撬岬膽?yīng)用已由最初的藥用為主，轉(zhuǎn)向以食品添加劑和營養(yǎng)保健品為主，已被廣泛用于各類保健食品中，成為普遍、大眾化的消費(fèi)品。
目前牛磺酸檢測方法有很多，如薄層色譜法[11]、高效液相色譜法[12-13]、液質(zhì)聯(lián)用法[14]、電位滴定法[15]、離子色譜法[16]等。這些方法缺點(diǎn)在于前處理操作繁瑣、耗時(shí)，影響因素較多，所需設(shè)備條件要求較高。而國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中?；撬岬臏y定》是現(xiàn)行檢測保健食品中?；撬嶂饕姆ǘ?biāo)準(zhǔn)[17]，其第一法為鄰苯二甲醛（OPA）柱后衍生高效液相色譜法；第二法為丹磺酰氯柱前衍生法，用紫外或熒光檢測器檢測。兩法樣品前處理繁雜耗時(shí)，OPA毒性較大，丹磺酰氯對光和濕敏感不穩(wěn)定，且衍生時(shí)間需2 h。
因此試驗(yàn)建立了全自動(dòng)氨基酸分析儀測定不同形態(tài)保健食品中?；撬岬暮?。樣品經(jīng)水超聲提取后，再經(jīng)離子交換柱層析分離，被分離出的?；撬嵬ㄟ^柱后與茚三酮溶液反應(yīng)顯色，在570 nm處通過外標(biāo)法定量檢測。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；茚三酮顯色溶液套裝（和光純藥株式會(huì)社）；氨基酸分析儀配套緩沖溶液（三菱化學(xué)株式會(huì)社）；?；撬釋φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號(hào)：111616-201605，含量100%）。
1.2 儀器與設(shè)備
L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀（日立Hitachi公司）；XPE205電子天平（瑞士梅特勒）；P300H超聲波清洗器（德國ELMA公司）；超純水儀（美國密理博公司）。
1.3 試驗(yàn)條件
離子交換柱：4.6 mm×60.0 mm（填料為離子交換樹脂，日立2622）；反應(yīng)柱：不銹鋼柱4.6 mm× 40.0 mm（填料為石英砂，日立855-3523）。交換柱柱溫57 ℃，反應(yīng)柱柱溫135 ℃，緩沖液流速0.4 mL·min-1，茚三酮流速0.35 mL·min-1。檢測波長570 nm，循環(huán)時(shí)間20 min，采集時(shí)間10 min，進(jìn)樣量20 μL。
1.4 試驗(yàn)方法
1.4.1 對照品溶液的制備
精密稱取57.85 mg對照品，置50 mL容量瓶中，加適量水，超聲5 min使其溶解，用水定容至刻度，得對照品儲(chǔ)備液。
1.4.2 供試品溶液的制備
1.4.2.1 液體樣品
取樣品混勻，取約1.0 mL（0.1～5 mL）樣品置50 mL容量瓶中，加適量水，超聲提取20 min，稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜即得。
1.4.2.2 固體樣品
取固體樣品置研缽中研細(xì)混勻，稱取約1.0 g（0.1～ 5 g）樣品置50 mL容量瓶中，加適量水，超聲提取20 min，稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜即得。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品前處理的優(yōu)化
試驗(yàn)以固體和液體2種不同形態(tài)的樣品作為供試品，分別考察以純水和0.02 mol/L HCl溶液作為溶劑的提取效果，并同時(shí)對超聲時(shí)間（15，20和25 min）進(jìn)行比較。結(jié)果表明，純水和0.02 mol/L HCl兩種溶劑對不同形態(tài)樣品中?；撬崽崛⌒Ч^好，超聲時(shí)間20 min能將?；撬崽崛⊥耆?。因此從能耗環(huán)保等方面綜合考慮，選擇純水作為提取溶劑，超聲時(shí)間為20 min。
2.2 線性關(guān)系考察
精密移取適量對照品儲(chǔ)備液，用水稀釋制成質(zhì)量濃度為5.79，11.57，23.14，46.28和115.70 μg·mL-1的系列溶液，進(jìn)樣量為20 μL。測定色譜峰面積，以?；撬釢舛龋╔，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，?；撬岱迕娣e（Y，mV）為縱坐標(biāo)，求得回歸方程Y=219 093X+59 387（r=1.000 0）。表明?；撬嵩?.79～115.70 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，色譜圖見圖1。
2.3 儀器精密度試驗(yàn)
精密吸取對照品溶液（46.28 μg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣6次，?；撬岱迕娣eRSD為0.29%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.4 重復(fù)性試驗(yàn)
按照2.3項(xiàng)下方法，制備兩種不同形態(tài)樣品，各6份，計(jì)算其中?；撬岷考癛SD（n=6）。固體制劑?；撬岷繛?1 243 mg·kg-1，RSD為0.39%；液體制劑?；撬岷繛? 045 mg·kg-1，RSD為0.42%，表明方法重復(fù)性良好。
2.5 定量限和檢測限
以牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜響應(yīng)值計(jì)算，當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，測得儀器的檢出限為0.064 μg·mL-1，換算得到方法的檢測限為3.2 mg·kg-1；當(dāng)信噪比（S/N）為10時(shí)，測得儀器的定量為0.214 μg·mL-1，方法的定量限為10.7 mg·kg-1。
2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別取同一份固體樣品和液體樣品，在0，2，7.5，13，24和48 h重復(fù)進(jìn)樣，記錄樣品中?；撬岬姆迕娣e，測得峰面積RSD分別為0.52%和0.68%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)
取已知含量的固體樣品和液體樣品，各9份，其中固體樣品每份約0.05 g，液體樣品每份0.5 mL，分別加入0.1，1.0和2.5 mL對照品儲(chǔ)備液，按照2.3項(xiàng)下方法提取、制備，分別作為低、中、高濃度供試品溶液，每個(gè)濃度平行3份，每份平行測定6次，其中固體樣品進(jìn)樣量為10 μL，液體樣品進(jìn)樣量為20 μL，按2.1項(xiàng)下測定結(jié)果，平均回收率為98.59%～100.78%，RSD為0.33%～1.90%（n=6）。結(jié)果見表1。
2.8 專屬性試驗(yàn)
將樣品溶液與17種氨基酸混合對照品溶液制成適合濃度的混度溶液，通過氨基酸分析儀進(jìn)行分析。通過試驗(yàn)可知，樣品中?；撬崤c17種氨基酸出峰互不干擾，實(shí)現(xiàn)基線分離，可以與17種氨基酸同時(shí)測定，結(jié)果見圖2。
圖1 樣品與對照品色譜圖
表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）
圖2 樣品中牛磺酸與17種氨基酸色譜圖
2.9 樣品測定
抽取近期抽樣檢測收集的含?；撬岬谋＝∈称?，共7批。按照2.3項(xiàng)下制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下測定，結(jié)果見表2。
表2 樣品含量測試結(jié)果（n=2）
3 結(jié)論
該研究成功建立了一種基于L-8900氨基酸分析儀檢測不同形態(tài)保健食品中?；撬岬臋z測方法。在試驗(yàn)條件下，該法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析時(shí)間短、樣品前處理簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、不需要衍生化試劑，減少人工衍生帶來的偶然誤差。此外，該法可以實(shí)現(xiàn)?；撬崤c常規(guī)17種氨基酸的同時(shí)測定，互不干擾。該試驗(yàn)結(jié)果豐富了保健食品中牛磺酸含量檢測的相關(guān)研究，為進(jìn)一步研究和制定保健食品中牛磺酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持。
