鄒孝，張麗妮，童蘭艷，陸嘉莉，余文琴，牟瓊

重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶市食品安全工程技術(shù)研究中心，國(guó)家農(nóng)副加工及調(diào)味品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（重慶401123）

酒精在發(fā)酵過(guò)程中易形成苦澀味道[1]，為改善發(fā)酵酒、蒸餾酒品質(zhì)，使其具有醇甜口感，不法商家向發(fā)酵酒、蒸餾中非法添加人工合成甜味劑時(shí)有發(fā)生[2]。人工合成甜味劑對(duì)人沒(méi)有直接的害處，但可能會(huì)影響人體的代謝，其安全性問(wèn)題尚無(wú)定論[3]。為保證食品安全，GB 2760—2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[4]對(duì)食品添加劑使用范圍和限量做了明確規(guī)定，其中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、紐甜、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖苷和三氯蔗糖均不允許添加到蒸餾酒中；發(fā)酵酒中可以少量添加紐甜（0.033 g/kg）和三氯蔗糖（0.65 g/kg）以外，其余甜味劑均不允許添加至發(fā)酵酒中。

目前已有的分析方法[5-7]中最常用的是液相色譜法，但液相色譜法檢測(cè)存在靈敏度、分辨率不高，多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)分離效果不好等問(wèn)題。研究者采用高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)開(kāi)展多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)方法研究[8-11]，但同時(shí)監(jiān)測(cè)安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、紐甜、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖苷、三氯蔗糖的方法鮮有報(bào)道。質(zhì)譜檢測(cè)手段以高靈敏度與較強(qiáng)的抗干擾能力，逐漸成為微量或者痕量成分檢測(cè)的首選[12-13]。試驗(yàn)建立發(fā)酵酒與蒸餾酒中8種人工合成甜味劑的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，為發(fā)酵酒與蒸餾酒中人工合成甜味劑檢測(cè)的準(zhǔn)確判定、快速檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平（Quintix 224-1CN，Sartorius公司）；三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（質(zhì)譜API 4000、液相Agilent 1290）；超純水機(jī)（Advantage A 10，美國(guó)Millipore公司）；超聲儀（SB-1500 DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）；圓周振蕩器（IKA VORTEX3）。

甲醇（HPLC級(jí)，Tedia公司）；甲酸（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；乙酸（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；安賽蜜（純度≥99.5%，Dr. Ehrenstorfer）；糖精鈉（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，GBW（E）100008）；甜蜜素（純度≥99.9%，Dr. Ehrenstorfer）；紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99.0%，CDAA-240006）；阿斯巴甜（純度≥99.2%，Dr. Ehrenstorfer）；阿力甜（純度≥99%，加拿大TRC公司）；甜菊糖苷（純度≥99%，加拿大TRC公司）和三氯蔗糖（純度≥99.7%，Dr. Ehrenstorfer）。

白酒、啤酒和葡萄酒均購(gòu)自本地超市、酒品專(zhuān)營(yíng)店。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg（精確到0.1 mg）安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，得到質(zhì)量濃度1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg（精確到0.1 mg）紐甜標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（1︰1，V/V）溶解并定容，得到質(zhì)量濃度1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg（精確到0.1 mg）甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

分別移取0.05 mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL容量瓶，用超純水定容。制成1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取100，200，500，1 000，2 000，4 000，6 000，8 000和10 000 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，得到0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品處理

1.3.1 白酒

白酒中乙醇的含量較高，取5 g（精確至0.000 1 g）白酒樣品，用水浴鍋加熱除盡乙醇，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.3.2 啤酒

啤酒因中含有大量二氧化碳，取10 mL啤酒樣品，用超聲波機(jī)脫氣10 min，取5 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.3.3 葡萄酒

取10 mL葡萄酒樣品，使用超聲波脫氣5 min，取5 g（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 HPLC條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A，0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B，0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.6 mL/min。洗脫梯度程序見(jiàn)表1。

表1 4種甜味劑分離洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度（TEM）550 ℃；電噴霧電壓（IS）-4 500 V；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；霧化器壓力（GS1）50 Psi；氣簾氣壓力（CUR）25 Psi；輔助氣壓力（GS2）50 Psi；碰撞氣（CAD）6 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以100 μg/L甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，通過(guò)對(duì)離子源模式、碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定目標(biāo)物質(zhì)的離子對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表2。獲得的典型MRM圖見(jiàn)圖1。

表2 8種甜味劑的質(zhì)譜檢測(cè)條件

圖1 8種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

2.2 定量限和線性關(guān)系

在最優(yōu)條件下測(cè)試不同濃度的甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)其峰面積作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到8種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)，以信噪比（S/N= 3），計(jì)算出8種甜味劑的方法檢出限。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方法線性回歸方程、線性范圍及檢出限

2.3 回收率和精密度測(cè)定

向空白樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平，每個(gè)水平下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、紐甜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷在啤酒、葡萄酒和白酒中加標(biāo)回收率為83.5%～100.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于為2.33%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 啤酒、葡萄酒和白酒中8種甜味劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

接表4

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)重慶各大超市、酒品專(zhuān)營(yíng)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的10種啤酒、10種葡萄酒和10種散裝白酒進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，30個(gè)樣品中有1個(gè)葡萄酒、4個(gè)散裝白酒添加了人工合成甜味劑，啤酒中未檢出人工合成甜味劑。其中，7號(hào)葡萄酒樣品檢出了甜蜜素、紐甜，其質(zhì)量濃度分別為0.28和0.36 mg/L；1號(hào)散裝白酒檢出糖精鈉和甜蜜素，其質(zhì)量濃度分別為0.48和0.13 mg/L；3號(hào)散裝白酒檢出糖精鈉、甜蜜素和紐甜，其質(zhì)量濃度分別為0.66，0.28和0.098 mg/L；4號(hào)散裝白酒檢出紐甜，質(zhì)量濃度為0.11 mg/L；7號(hào)散裝白酒檢出甜蜜素和三氯蔗糖，其質(zhì)量濃度分別為0.39和0.27 mg/L。測(cè)試結(jié)果表明，重慶酒品市場(chǎng)存在非法添加甜味劑的現(xiàn)象，相關(guān)部門(mén)需要對(duì)相關(guān)現(xiàn)象進(jìn)行關(guān)注。

3 結(jié)論

建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵酒和蒸餾酒中8種人工合成甜味劑的方法，整個(gè)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單快捷，準(zhǔn)確度、靈敏度高，適用于發(fā)酵酒與蒸餾酒中多組分復(fù)合甜味劑的同時(shí)、快速定性、定量分析，其檢出限、回收率及精密度指標(biāo)均能夠滿足日常食品中人工合成甜味劑的市場(chǎng)監(jiān)管需要。