袁斯遠(yuǎn)，王瀟慧，孫江燕，劉金民

癲癇是由多種病因引起的慢性腦部疾患，以腦部神經(jīng)元過度放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的一種疾病。全世界目前大約有7 000萬人罹患癲癇，我國大約有900萬癲癇病人[1-2]。隨著第3代抗癲癇藥物(anti-epileptic drugs，AEDs)投入臨床使用，臨床上目前約有30種AEDs，但約有30%的病人為耐藥性癲癇[3]。2010年國際抗癲癇聯(lián)盟對(duì)耐藥性癲癇的定義達(dá)成共識(shí)，一是AEDs治療的結(jié)局分類：臨床無發(fā)作、治療失敗及不確定；二是在治療失敗的基礎(chǔ)上提出了耐藥性癲癇的核心定義：兩種正確選擇、可耐受的AEDs，經(jīng)足夠療程及劑量藥物治療(單藥或聯(lián)合用藥)仍未能控制發(fā)作的癲癇[4]。耐藥性癲癇的主要特征是癲癇病人對(duì)多種AEDs產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，從而降低了AEDs療效。因此，逆轉(zhuǎn)耐藥、增敏AEDs是改善耐藥性癲癇療效的重要突破口。

針對(duì)癲癇耐藥性發(fā)病機(jī)制目前存在6種假說[5]。其中1995年美國學(xué)者Tishler 提出的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體假說，20余年來受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注。該假說認(rèn)為癲癇的反復(fù)發(fā)作或長(zhǎng)時(shí)間的服用抗癲癇藥物能夠引起癲癇病人血腦屏障中多藥耐藥基因1a(Multidrug resistance gene 1 a，Mdr1a)mRNA與其編碼P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)高表達(dá)，高表達(dá)的P-gp能夠通過水解三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)獲取能量將AEDs逆濃度梯度外排出腦組織，從而降低腦組織中AEDs的濃度，進(jìn)而引起癲癇耐藥性[6]。因此，腦組織中Mdr1a mRNA與 P-gp的高表達(dá)是產(chǎn)生癲癇耐藥的主要機(jī)制之一。

課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方柴貝止癇湯(柴胡、浙貝母、法半夏、天麻、石菖蒲、地龍、牡蠣)能夠下調(diào)難治性癲癇大鼠模型海馬與皮層中高表達(dá)的P-gp 與Mdr1a mRNA[7-9]。依據(jù)現(xiàn)代生物方劑分析藥理研究策略的指導(dǎo)，使用LC-MS技術(shù)對(duì)柴貝止癇湯成分血漿動(dòng)力學(xué)濃度進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)α細(xì)辛醚為柴貝止癇湯主要吸收入血效用成分之一，推測(cè)α細(xì)辛醚可能是柴貝止癇湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10-11]。α細(xì)辛醚為中藥石菖蒲主要揮發(fā)油成分之一，石菖蒲芳香開竅，為中醫(yī)腦病臨床常用的引經(jīng)藥。在中醫(yī)“芳香開竅”的理論指導(dǎo)下，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)石菖蒲、石菖蒲揮發(fā)油組分以及α細(xì)辛醚皆能夠下調(diào)耐藥性細(xì)胞系Caco-2上P-gp與Mdr1a mRNA的表達(dá)[12-13]?；谝陨涎芯勘尘?，本研究通過反復(fù)腹腔注射戊四氮(pentamethazol，PTZ)所致耐藥性癲癇大鼠模型，觀察α細(xì)辛醚對(duì)耐藥性癲癇大鼠模型海馬與皮層中P-gp與Mdr1a mRNA表達(dá)的影響，為中醫(yī)藥扭轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的耐藥性癲癇提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)Wistar大鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004]，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室。

1.2 藥品 α細(xì)辛醚與戊四氮購于上海源葉生物科技有限公司，卡馬西平與苯妥英鈉購于北京諾華制藥有限公司。

1.3 試劑 P-gp 抗體(ab3366，Abcam)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗(MD2142，北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(MD2141，北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，SuperScript Ⅲ RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(11752050，ABI-invitrogen)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus(4472920，ABI-invitrogen)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用腹腔注射戊四氮制造耐藥性癲癇大鼠模型。

1.4.1.1 癲癇大鼠模型 隔日腹腔注射戊四氮(30 mg/kg)，共注射15次，造模期間觀察大鼠癲癇發(fā)作情況。按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將大鼠癲癇發(fā)作分為5級(jí)，Ⅰ級(jí)：咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐；Ⅱ級(jí)：以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉抽搐；Ⅲ級(jí)：?jiǎn)蝹?cè)前肢陣攣、抽搐；Ⅳ級(jí)：雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起；Ⅴ級(jí)：雙側(cè)后肢強(qiáng)直，身體背曲強(qiáng)直，跌倒伴全身陣攣。連續(xù)3次出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作者為癲癇造模成功。

1.4.1.2 耐藥性癲癇大鼠模型篩選 將造模成功的癲癇大鼠灌服卡馬西平(125 mg/kg)與苯妥英鈉(62.5 mg/kg)1 h后，腹腔注射戊四氮(30 mg/kg)，觀察大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別，連續(xù)3次出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作者視為耐藥性癲癇大鼠，耐藥性癲癇大鼠模型篩選實(shí)驗(yàn)持續(xù)7 d。

1.4.2 分組及給藥方法 將24只造模成功的耐藥性癲癇模型大鼠隨機(jī)分為α細(xì)辛醚低劑量組(低劑量組)、α細(xì)辛醚高劑量組(高劑量組)與模型組，每組8只，另選8只大鼠為正常組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。α細(xì)辛醚低、高劑量組分別給予25 mg/kg和50 mg/kg α細(xì)辛醚灌胃；正常組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。共持續(xù)給藥3周，3周后取材，摘取大鼠海馬與皮層組織進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 Western Blot檢測(cè)P-gp的表達(dá) 將大鼠海馬與皮層組織勻漿，提取蛋白，應(yīng)用BCA 試劑盒定量蛋白濃度。分離膠濃度5%，調(diào)節(jié)樣本蛋白濃度為5 μg/μL，180 V電泳15 min，100 V繼續(xù)電泳1.5 h。297 mA轉(zhuǎn)膜3 h。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜以5%脫脂奶粉封閉 90 min。封閉完成后將PVDF膜依據(jù)Marker剪開，分別孵育P-gp一抗(稀釋比1∶50)及GAPDH一抗(稀釋比1∶500)，4 ℃過夜。洗脫，孵育二抗(兩指標(biāo)二抗稀釋比均為1∶2 000)，洗脫，ECL發(fā)光，圖像采集。

1.5.2 Real time PCR檢測(cè)Mdr1a mRNA的表達(dá) Trizol試劑提取總RNA。Mdr1a上游引物為5′- GTG AAA GGG GCT ACA GGG TC -3′，下游引物為5′- AGT GTC AAT TGC CAG CCG TA -3′； β-actin上游引物為5′- GTT ACC AGG GCT GCC TTC TC -3′，下游引物為5′- GGG TTT CCC GTT GAT GACC -3′。反應(yīng)總體積20 μL；qPCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min→94 ℃ 20 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 α細(xì)辛醚對(duì)大鼠海馬組織中P-gp表達(dá)的影響 經(jīng)戊四氮反復(fù)點(diǎn)燃后，模型組海馬組織中P-gp表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05)。α細(xì)辛醚干預(yù)3周后，低劑量組、高劑量組海馬組織中P-gp表達(dá)量均下調(diào)，高劑量組與模型組相比海馬組織中P-gp表達(dá)量下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

與模型組比較，＊P<0.05

2.2 α細(xì)辛醚對(duì)大鼠皮層組織中P-gp表達(dá)的影響 經(jīng)戊四氮反復(fù)點(diǎn)燃后，模型組皮層組織中P-gp表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05)。α細(xì)辛醚干預(yù)3周后，低劑量組、高劑量組皮層組織中P-gp表達(dá)量均下調(diào)，高劑量組與模型組相比皮層組織中P-gp表達(dá)量下調(diào)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

與模型組比較，＊P<0.05

2.3 α細(xì)辛醚對(duì)大鼠海馬組織中Mdr1a mRNA表達(dá)的影響 模型組大鼠海馬組織中Mdr1a mRNA表達(dá)量較正常組明顯升高(P<0.05)。經(jīng)α細(xì)辛醚干預(yù)3周后，低劑量組、高劑量組大鼠海馬組織中Mdr1a mRNA表達(dá)量均降低，其中高劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組海馬組織中Mdr1amRNA表達(dá)比較(±s)

與模型組相比，1)P<0.05

2.4 α細(xì)辛醚對(duì)大鼠皮層組織中Mdr1a mRNA表達(dá)的影響 模型組大鼠皮層組織中Mdr1a mRNA表達(dá)量較正常組明顯升高(P<0.05)。經(jīng)α細(xì)辛醚干預(yù)3周后，低劑量組、高劑量組大鼠皮層組織Mdr1a mRNA表達(dá)量均降低，其中高劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠皮層組織中Mdr1amRNA表達(dá)比較(±s)

與模型組相比，1)P<0.05

3 討 論

耐藥性癲癇病人最主要的特征是對(duì)大部分AEDs 耐藥，即使這些 AEDs的作用途徑不同。針對(duì)癲癇耐藥性發(fā)病機(jī)制目前存在6種假說[5]，其中多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體假說受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注。該假說認(rèn)為癲癇的反復(fù)發(fā)作或長(zhǎng)時(shí)間的服用抗癲癇藥物能夠引起癲癇病人血腦屏障中Mdr1a mRNA與其編碼P-gp高表達(dá)，高表達(dá)的P-gp能夠?qū)EDs逆濃度梯度外排出腦組織，從而降低腦組織中抗癲癇藥物的濃度，進(jìn)而引起癲癇耐藥性[6]。因此，降低腦組織中P-gp與Mdr1a mRNA的高表達(dá)為扭轉(zhuǎn)癲癇耐藥性的主要途徑之一。

課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方柴貝止癇湯(柴胡、浙貝母、法半夏、天麻、石菖蒲、地龍、牡蠣)能夠下調(diào)難治性癲癇大鼠模型海馬與皮層中高表達(dá)的P-gp 與Mdr1a mRNA[7-9]。依據(jù)現(xiàn)代生物方劑分析藥理研究策略的指導(dǎo)，使用LC-MS技術(shù)對(duì)柴貝止癇湯成分血漿動(dòng)力學(xué)濃度進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)α細(xì)辛醚為柴貝止癇湯主要吸收入血效用成分之一，由此推論α細(xì)辛醚可能是柴貝止癇湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10-11]。

α細(xì)辛醚為中藥石菖蒲揮發(fā)油成分之一。19 世紀(jì)80年代，從石菖蒲中提取分離出α細(xì)辛醚并且推斷其為石菖蒲的主要效用成分之一。自此，α細(xì)辛醚藥理學(xué)作用被廣泛研究。實(shí)驗(yàn)研究顯示α細(xì)辛醚可用于癲癇、抑郁、焦慮、阿爾茨海默病、帕金森病、失眠以及高血脂等疾病的治療。并且其廣泛的藥理學(xué)作用主要取決于其多種生物活性，例如抗驚厥、鎮(zhèn)靜、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎以及降血脂等[14-18]。

在中醫(yī)“芳香開竅”的理論指導(dǎo)下，有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)中藥石菖蒲、石菖蒲揮發(fā)油組分以及α細(xì)辛醚皆能夠下調(diào)耐藥性細(xì)胞系Caco-2上P-gp與Mdr1a mRNA的表達(dá)[12-13]。本研究以戊四氮反復(fù)點(diǎn)燃所致的 P-gp高表達(dá)的耐藥性癲癇大鼠為研究對(duì)象，使用α細(xì)辛醚干預(yù)3周后，以50 mg/kg劑量α細(xì)辛醚干預(yù)的大鼠腦組織中P-gp和Mdr1a mRNA的表達(dá)量較模型組明顯下降。因此，α細(xì)辛醚可能扭轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的癲癇耐藥性，為復(fù)方柴貝止癇湯扭轉(zhuǎn)耐藥性癲癇的藥理學(xué)基礎(chǔ)；有關(guān)α細(xì)辛醚下調(diào)P-gp的確切機(jī)制則需要進(jìn)一步探究。