蔡 蕓，信琪琪，高 群，賈文浩，靳嘉麟，董 菲，叢偉紅，林 謙

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一[1]，其患病率和發(fā)病率都在持續(xù)升高，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量。心房基質(zhì)重構(gòu)和電重構(gòu)是心房顫動發(fā)生和維持的關(guān)鍵病理機(jī)制[2]。心房顫動屬中醫(yī)“心悸”范疇，痰熱擾心證已成為心房顫動病人的常見證候之一[3]。黃連源于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[4]，針對心房顫動痰熱擾心的病機(jī)，現(xiàn)代醫(yī)家多加用黃連以發(fā)揮清心降火功效，往往可以取得較好的效果，但其作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，運(yùn)用專業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件，通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)，分析其協(xié)同關(guān)系的新學(xué)科。其強(qiáng)調(diào)中藥對疾病的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)作用，從網(wǎng)絡(luò)層面闡釋中藥治療疾病的作用機(jī)制[5]，目前已廣泛應(yīng)用到新藥開發(fā)、多靶點(diǎn)治療藥物等方面[6]。中藥多具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特征，因此本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析、預(yù)測黃連治療心房顫動的藥效基礎(chǔ)、作用靶點(diǎn)，為從分子水平、細(xì)胞水平和基因水平闡明黃連的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 方 法

1.1 黃連成分潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data-base and Analysis Platform)數(shù)據(jù)庫中檢索黃連所有成分及靶點(diǎn)，通過口服生物利用度(OB)、藥物相似性(DL)進(jìn)行活性成分篩選，閾值設(shè)定為OB>30%、DL>0.18，Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白基因名的轉(zhuǎn)換，再通過Cytoscape3.2.1軟件對成分、潛在靶點(diǎn)進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，利用Bisogenet插件構(gòu)建成分靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.2 心房顫動疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以“atrial fibrillation”為關(guān)鍵詞分別檢索TTD、DrugBank、美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫，獲得疾病靶點(diǎn)，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白基因名的轉(zhuǎn)換，再通過Cytoscape3.2.1軟件進(jìn)行疾病靶點(diǎn)可視化構(gòu)建，利用Bisogenet插件構(gòu)建疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape3.2.1軟件的Merge功能，將以上構(gòu)建得到的“成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)”與“疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)”進(jìn)行Merge分析，得到藥物-疾病共同相關(guān)的靶點(diǎn)，進(jìn)一步通過Cytoscape的CytoNCA插件對“成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算出度值，進(jìn)行核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析。

1.4 基因富集通路可視化分析 利用David數(shù)據(jù)庫將藥物-疾病共同相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行Go注釋與KEGG富集通路分析，通過OmicShare平臺以高級氣泡圖進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 黃連成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 本研究通過OB、DL參數(shù)作為ADME篩選條件，刪除冗雜后最終得到11個(gè)活性成分、172個(gè)潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建得到的可視化網(wǎng)絡(luò)(見圖1)，包含180個(gè)節(jié)點(diǎn)和260條邊；通過Bisogenet插件構(gòu)建黃連成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖2)，得到5 887個(gè)黃連潛在靶點(diǎn)，共145 163條邊。其中對治療心房顫動可能有作用的黃連活性成分主要包括小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿、四氫小檗堿、小檗浸堿、黃麻苷A、木蘭花堿、巴馬汀、槲皮素、黃連堿、甲基黃連堿等(見表1)。

黃色代表黃連成分，紅色代表靶點(diǎn)

編號 CAS號 名稱OB(%)DLMOL001454633-66-9/2086-83-1berberine(小檗堿)36.860.78MOL00289415401-69-1/17388-19-1berberrubine(小檗紅堿)35.740.73MOL0028971816598epiberberine(表小檗堿)43.090.78MOL002903522-97-4(R)-Canadine(四氫小檗堿)55.370.77MOL002904549-21-3Berlambine(小檗浸堿)36.680.82MOL002907N/ACorchoroside A_qt(黃麻苷A)104.95 0.78MOL00062292618-98-9Magnograndiolide(木蘭花堿)63.710.19MOL0007853486-67-7/10605-02-4palmatine(巴馬汀)64.600.65MOL00009873123-10-1/74893-81-5/117-39-5quercetin(槲皮素)46.430.28MOL0014583486-66-6/6020-18-4coptisine(黃連堿)30.670.86MOL00266838763-29-0Worenine(甲基黃連堿)45.830.87

2.2 心房顫動疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 349個(gè)疾病靶點(diǎn)通過NCBI數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)(見圖3)及“疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)”(見圖4)，得到6 414個(gè)潛在疾病靶點(diǎn)，共153 752條邊。

圖3 疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖4 疾病-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò) “成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)”與“疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)”Merge分析后構(gòu)建的“成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”(見圖5)，包括4 517個(gè)藥物-疾病共同的靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過Cytoscape的CytoNCA插件對“成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”進(jìn)行拓?fù)浞治觯紫扔?jì)算出Degree值中位數(shù)為33，然后篩選出度值大于中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)，為1 098個(gè)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)(見圖6)，為增加富集度，繼續(xù)通過CytoNCA插件對1 098個(gè)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算出Degree值中位數(shù)為71，然后篩選出度值大于中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)為159個(gè)作為核心成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，最后構(gòu)建“核心成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”(見圖7)，其中包括159個(gè)疾病靶點(diǎn)和11個(gè)活性成分。

圖5 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖6 1098個(gè)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)

圖7 核心成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 KEGG富集通路信息 利用David對159個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO基因注釋，通過高級氣泡圖進(jìn)行可視化(見圖8)。對159個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，得到20條信號通路(見圖9)，橫坐標(biāo)表示富集因子，縱坐標(biāo)表示通路，圓點(diǎn)顏色代表P值，顏色越鮮艷，則P值越小，基因在此通路上的富集顯著性越高；圓點(diǎn)大小表示基因數(shù)，越大則富集基因數(shù)越多。圖8為顯著性前20的富集結(jié)果，包括基因表達(dá)負(fù)調(diào)控-表觀遺傳、端粒組織、DNA復(fù)制依賴核小體組裝、蛋白質(zhì)異源四聚體、rDNA染色質(zhì)沉默、基因表達(dá)的正調(diào)控-表觀遺傳、細(xì)胞蛋白代謝過程、核轉(zhuǎn)錄的mRNA分解代謝過程-無意義介導(dǎo)的衰變、SRP依賴的靶向膜共轉(zhuǎn)化蛋白、核小體組裝、翻譯啟動、病毒轉(zhuǎn)錄、RNA基因沉默、β-連環(huán)蛋白TCF復(fù)合物裝配、端粒封頂、巨核細(xì)胞分化負(fù)調(diào)控、非同源端接雙股斷裂修復(fù)、翻譯、rRNA處理、與DNA復(fù)制無關(guān)的核小體組裝等?；騅EGG通路富集分析(見表2)發(fā)現(xiàn)黃連治療心房顫動主要通過酒精中毒、核糖體、細(xì)胞周期、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、甲狀腺激素信號通路、拼接體、雌激素信號通路、Epstein-Barr病毒感染、PI3K-Akt信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、DNA復(fù)制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、粘合連接、核苷酸切除修復(fù)、Notch信號通路、抗原處理和呈現(xiàn)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、結(jié)節(jié)樣受體信號通路、非同源末端連接等方面干預(yù)心房顫動。每條通路涉及的基因見表3。

圖8 159個(gè)成分靶點(diǎn)GO注釋生物過程氣泡圖

圖9 159個(gè)成分靶點(diǎn)富集通路氣泡圖

編號 通路名稱基因數(shù)百分比(%)hsa05034Alcoholism(酒精中毒)3018.867 924 53hsa03010Ribosome(核糖體)2616.352 201 26hsa04110Cell cycle(細(xì)胞周期)1610.062 893 08hsa04120Ubiquitin mediated proteolysis(泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解)159.433 962 264hsa04919Thyroid hormone signaling pathway(甲狀腺激素信號通路)127.547 169 811hsa03040Spliceosome(拼接體)127.547 169 811hsa04915Estrogen signaling pathway(雌激素信號通路)106.289 308 176hsa05169Epstein-Barr virus infection(Epstein-Barr病毒感染)116.918 238 994hsa04151PI3K-Akt signaling pathway(PI3K/-Akt信號通路)1911.94 968 553hsa04010MAPK signaling pathway(MAPK信號通路)159.433 962 264hsa04066HIF-1 signaling pathway(HIF-1信號通路)85.031 446 541hsa03030DNA replication(DNA復(fù)制)53.144 654 088hsa04141Protein processing in endoplasmic reticulum(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工)106.289 308 176hsa04520Adherens junction(粘合連接)63.773 584 906hsa03420Nucleotide excision repair(核苷酸切除修復(fù))53.144 654 088hsa04330Notch signaling pathway(Notch信號通路)53.144 654 088hsa04612Antigen processing and presentation(抗原處理和呈現(xiàn))63.773 584 906hsa04114Oocyte meiosis(卵母細(xì)胞減數(shù)分裂)74.402 515 723hsa04621NOD-like receptor signaling pathway(結(jié)節(jié)樣受體信號通路)53.144 654 088hsa03450Non-homologous end-joining(非同源末端連接)31.886 792 453

表3 20條通路基因信息

3 討 論

我國2019年中國心血管病報(bào)告提出，中國≥35歲居民的心房顫動患病率為0.71%，極大地危害病人的健康[7]。目前，心房顫動的西醫(yī)治療方法可分為“節(jié)律控制”“室率控制”，主要干預(yù)手段為抗心律失常藥物和射頻消融術(shù)[8]，但存在抗心律失常藥物藥理機(jī)制復(fù)雜、遠(yuǎn)期致心律失常作用、手術(shù)需嚴(yán)格適應(yīng)證等不足[9]。心房基質(zhì)重構(gòu)和電重構(gòu)是心房顫動發(fā)生和維持的關(guān)鍵病理機(jī)制，心房纖維化是心房基質(zhì)重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式，心房纖維化或炎癥等病理學(xué)改變導(dǎo)致的心房擴(kuò)張，會加重心房纖維化的進(jìn)程進(jìn)一步誘發(fā)心房顫動，同時(shí)，心房纖維化和心房擴(kuò)張也能導(dǎo)致心房電功能的改變，造成惡性循環(huán)[2]。心房顫動已成為心血管領(lǐng)域防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)，開發(fā)新的有效治療措施具有重要意義。

心房顫動臨床多以心慌為主癥，屬中醫(yī)“心悸”范疇，其基本病機(jī)不外虛實(shí)兩個(gè)方面，虛者為氣血陰陽虧損，心神失養(yǎng)所致；實(shí)者則多由痰熱、水飲、瘀血等實(shí)邪所致[10]。隨著現(xiàn)代生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，肥甘厚味極易傷及脾胃，以致脾失健運(yùn)，痰濕內(nèi)生，郁而化熱，痰熱內(nèi)擾，心神不安，而致心悸，表現(xiàn)為心慌間斷發(fā)作、胸悶、口苦、煩躁失眠等癥狀[11]。針對心房顫動痰熱擾心的病機(jī)，現(xiàn)代醫(yī)家多加用黃連以發(fā)揮清心降火功效。目前黃連廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)疾病治療，特別是在防治快速性心律失常方面。既往臨床研究證實(shí)，含黃連方劑可有效改善快速型心律失常疾病癥狀，防止疾病的進(jìn)展[12-16]。課題組前期臨床實(shí)踐表明，含黃連方劑參連復(fù)脈顆粒具有益氣活血、清心化痰、安神復(fù)脈功效，其中黃連苦寒入心經(jīng)，為臣藥，具有清心降火、安神止悸之功[17]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連中多種活性成分具有抗心律失常作用[18]，如小檗堿、巴馬汀等[19-22]，機(jī)制可能與其延長動作電位時(shí)間和有效不應(yīng)期、改善心肌缺血狀態(tài)、阻斷α-受體、改善炎癥狀態(tài)等多方面有關(guān)[23]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)篩選得到黃連活性成分和心房顫動疾病靶點(diǎn)，分別構(gòu)建成分和疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Merge分析，得到藥物-疾病共同相關(guān)的核心靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行富集通路分析，結(jié)果顯示有11個(gè)活性成分可以直接或間接作用于159個(gè)靶點(diǎn)，5 106條邊，涉及20條疾病通路，其中針對心房顫動有效的黃連活性成分主要包括小檗堿、小檗紅堿、巴馬汀等，它們可能通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、蛋白代謝、巨核細(xì)胞分化等生物過程及PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、Notch等信號通路來發(fā)揮治療心房顫動的作用。

中藥成分復(fù)雜多樣，能夠作用于多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路，通過君、臣、佐、使的配伍原則作用于疾病，從而實(shí)現(xiàn)中藥對機(jī)體的整體調(diào)控，明確其藥效物質(zhì)及作用機(jī)制，將更有利于推進(jìn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化進(jìn)程[24]。黃連清心降火、安神止悸，臨床用于痰熱擾心證的心房顫動，療效明確。從黃連成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，同一活性成分可作用于不同靶點(diǎn)，不同活性成分也可作用于相同靶點(diǎn)，體現(xiàn)出黃連多成分、多靶點(diǎn)治療疾病的作用特點(diǎn)，從PPI網(wǎng)絡(luò)可看出，靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)情況復(fù)雜，數(shù)目眾多。由此可見，黃連多成分、多靶點(diǎn)、蛋白靶點(diǎn)之間關(guān)聯(lián)作用的特點(diǎn)，可為解釋其異病同治的作用機(jī)制提供參考。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析黃連活性成分及心房顫動靶點(diǎn)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)黃連活性成分小檗堿、小檗紅堿等可能通過抑制基因表達(dá)、抑制巨核細(xì)胞分化、抗蛋白代謝等途徑共同發(fā)揮抗心房顫動的作用。本研究初步探索和預(yù)測了黃連治療心房顫動的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子生物學(xué)機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證其作用機(jī)制提供了依據(jù)。