陳鴻申，謝國芳，張明生，王 倩，幸菲菲

（貴州大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院 國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心；b.山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

狐臭柴Premna puberulaPamp.又名神仙豆腐柴、斑鳩占、臭樹、水白臘等，隸屬馬鞭草科豆腐柴屬的多年生直立或攀援灌木，主要生長于我國貴州、四川、云南、湖北、湖南、甘肅及陜西南部等地海拔在700～1 800 m 的山坡路邊叢林中[1]。其根、莖、葉中含有多種藥用成分[2-3]，具有清熱解毒、消腫止血等功效，有治療毒蛇咬傷、無名腫毒、創(chuàng)傷出血的作用[4]。狐臭柴葉片中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、可溶性糖、維生素、纖維素、過氧化物酶及豐富的果膠[5-6]，其果膠由α-半乳糖單體聚合而成，具有良好的凝膠、增稠、穩(wěn)定等性能，被廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)[7]。我國是果膠需求大國，每年消耗果膠約1 500 t 以上，其中80%需進(jìn)口[8]。據(jù)報道，豆腐柴屬植物葉片中果膠含量達(dá)30%～40%[9]，目前雖有不少關(guān)于這類植物果膠提取的研究文獻(xiàn)[10-16]，但提取原料均為干葉，其工藝需將鮮葉烘干粉碎后過篩處理，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本增加，操作較為耗時、繁瑣。因此，本研究以狐臭柴鮮葉為原料，在單因素實驗基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化其果膠提取條件，以期為高效利用狐臭柴葉片果膠提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：狐臭柴野生資源來自貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定，已在貴州大學(xué)實驗基地人工種植多年。

生化試劑：D-半乳糖醛酸標(biāo)品（上海源葉生物科技有限公司，純度＞97%），咔唑（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%），無水乙醇（天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司，分析純），濃硫酸（南京盛慶和化工有限公司，分析純），檸檬酸（天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

于生長旺季（8月份）采集貴州大學(xué)實驗基地的狐臭柴葉片，于-20 ℃條件下殺青1 h（低溫殺青有利于活性成分的保留），洗凈、晾干表面水分后碎備用。

果膠的酸解與提取參照Pinheiro E S 等[17]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。

1）酸解：稱取備用的狐臭柴鮮葉15.0 g（m）于料理機中，加入150 mL 檸檬酸溶液（6.0%）后電動攪拌1～2 min，漿液平均倒入3 只燒杯中，按試驗設(shè)定水浴溫度進(jìn)行浸提。

2）抽濾：趁熱用真空泵將酸解液以100 目篩子抽濾。

3）沉淀：抽濾液濃縮后以冷凍的1.2 倍體積無水乙醇（較低溫度的乙醇有利于沉淀生成）沉淀，于4 ℃冰箱中靜置1 h 使果膠沉淀。

4）過濾、烘干及測定：過濾收集沉淀的果膠并以無水乙醇清洗干凈，40 ℃烘箱中烘干得到果膠粗品，用研缽磨細(xì)后稱量。

1.2.2 果膠提取的單因素實驗

設(shè)置不同梯度的液料比（酸解液mL ∶鮮葉g =5:1、6:1、8:1、10:1、12:1）、檸檬酸含量%（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0）、提取溫度（55、65、75、85、95 ℃）和提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h），以果膠提取率為評價指標(biāo)，考查液料比、檸檬酸含量、提取溫度及提取時間對果膠提取的影響。

1.2.3 果膠提取條件優(yōu)化實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，運用Design-Expert 8.0.6軟件程序根據(jù)Box-Behnken 實驗設(shè)計原理，設(shè)計4 因素3 水平，以液料比(A)、檸檬酸含量(B)、提取溫度(C)及提取時間(D)為影響因素，果膠提取率(Y)為響應(yīng)值，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化（表1）。

表1 Box-Behnken 試驗因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.2.4 分析檢測

目前，醫(yī)院對水電氣能耗的統(tǒng)計還停留在傳統(tǒng)方式上，表計不全，科室能源消耗不明，樓宇能耗信息不清楚，給管理者制定決策帶來一定難度。建設(shè)能耗監(jiān)控智能平臺刻不容緩。能耗監(jiān)控平臺基于智能化表計，互聯(lián)網(wǎng)，以及操作平臺，表計將各個用能單元準(zhǔn)確計量，通過統(tǒng)一的協(xié)議傳輸?shù)椒?wù)器，管理者通過操作界面獲取能耗相關(guān)信息。能耗監(jiān)控平臺可提供樓宇能耗信息，科室能耗信息及對比，并能進(jìn)行橫向和縱向?qū)Ρ?，管理者可通過訪問服務(wù)器的方式隨時隨地查看醫(yī)院能耗信息。建設(shè)能耗監(jiān)控平臺后，醫(yī)院的能耗信息可全方位的展現(xiàn)在管理者面前，對科室精細(xì)化管理，節(jié)能措施的制定提供了真實可靠的參考依據(jù)。

采用咔唑-濃硫酸法[]18]測定果膠含量，其原理是果膠經(jīng)水解生成半乳糖醛酸，通常是在濃硫酸條件下與咔唑作用顯色并在紫外光照射下產(chǎn)生特征吸收。

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取半乳糖醛酸標(biāo)品0.100 3 g 于100 mL 容量瓶中（濃度為 1 000 mg/L），以1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液作為母液。取6 只試管編號，按表1依次加入各試劑，再依次加入0.2 mL0.15%咔唑乙醇溶液，觀察到有白色絮狀沉淀生成，不斷搖勻。再依次加入6 mL 濃硫酸，不斷搖動試管，再于85 ℃水浴中加熱30 min，取出冷卻搖勻（表2）。除空白外，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液呈現(xiàn)不同程度的顯色反應(yīng)（圖1a）。于波長530 nm 處測定吸光度，以吸光度值(y)為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1b）。

表2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制Table2 Preparation of standard galacturonic acid solution

圖1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of galacturonic acid

半乳糖醛酸含量測定：準(zhǔn)確稱取狐臭柴果膠樣品50 mg，配制成0.1%的溶液，精確量取1.0 mL待測液，按照半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制實驗步驟測定其吸光度值，并以半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算其含量。計算公式如下：

式（1）中：W為半乳糖醛酸含量（%）；C為提取液中半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（g/mL）；V為提取液體積（mL）；M1為狐臭柴果膠質(zhì)量（g）。

1.2.5 驗證性實驗

在響應(yīng)面優(yōu)化條件下，進(jìn)行驗證性試驗，與理論預(yù)測值進(jìn)行比較，以驗證優(yōu)化結(jié)果。

1.2.6 果膠含量的計算

Y=（CVW/M2）×100%。式中：C=X×稀釋倍數(shù)×106；C為提取液中D-半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（g/mL）；V為提取液體積（mL）；W為半乳糖醛酸含量（%）；M2為狐臭柴鮮葉質(zhì)量（g）；X為樣品中半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（μg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對狐臭柴鮮葉果膠提取率的影響

2.1.1 檸檬酸含量的影響

在檸檬酸含量為1.0%～8.0%（pH 值4.46～ 1.57）范圍內(nèi)，果膠提取率隨檸檬酸含量的增加逐漸上升而后趨于平衡；檸檬酸含量為6.0%時果膠提取率達(dá)最高（20.16%）；當(dāng)檸檬酸含量＞6.0%（pH 值1.69）時，果膠提取率呈下降趨勢（圖2）。上述結(jié)果可能是隨著檸檬酸含量的增加，解離出的H+趨于飽和，進(jìn)而影響其化學(xué)活性所致。因此，最適檸檬酸含量為6.0%。

圖2 不同檸檬酸含量對果膠提取率的影響Fig.2 Effects of different citric acid contents for pectin extraction rate

2.1.2 料液比的影響

液料比在5:1～10:1(mL:g)范圍內(nèi)，果膠提取率呈線性上升；當(dāng)液料比＞10:1(mL:g)之后，提取率趨于平衡（圖3）。這是因為液料比較小時，溶液的黏度較大，分子擴散速度低，提取率小，也可能是因為葉片中果膠含量與檸檬酸酸解程度相當(dāng)，反應(yīng)趨于平衡，提取率不再變化所致。因此，最適液料比為10:1(mL:g)。

圖3 不同液料比對果膠提取率的影響Fig.3 Effect of different ratio of liquid to material for pectin extraction rate

2.1.3 提取溫度的影響

提取溫度在55～85 ℃范圍內(nèi)，果膠提取率隨溫度升高而增大，這與分子熱運動加劇和檸檬酸的解離程度增強有關(guān)；提取溫度為85 ℃時，果膠提取率達(dá)最大（20.24%）；當(dāng)提取溫度＞85 ℃后，提取率趨于下降，這可能是隨著溫度的升高，破壞了果膠的結(jié)構(gòu)，致使其降解導(dǎo)致的。因此，最適提取溫度為85 ℃（圖4）。

圖4 不同提取溫度對果膠提取率的影響Fig.4 Effect of different extraction temperature for pectin extraction rate

2.1.4 提取時間的影響

提取時間在0.5～2.0 h 范圍時，提取率隨時間的延長呈線性增加；提取時間為2.0 h 時，果膠提取率最大（19.85%）；當(dāng)提取時間＞2.0 h 時，果膠提取率降低，這可能是半乳糖醛酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致降解造成的。因此，最適提取時間為2.0 h （圖5）。

圖5 提取時間對果膠提取率的影響Fig.5 Effect of different extraction time on pectin extraction rate

2.2 狐臭柴鮮葉果膠提取條件響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

以液料比(A)、檸檬酸含量(B)、提取溫度(C)及提取時間(D)為影響因素，以果膠提取率(Y)為響應(yīng)值，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken 響應(yīng)面實驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。利用Design-Expert 8.0.6 對表3結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到液料比(A)、檸檬酸含量(B)、提取溫度(C)以及提取時間(D)與響應(yīng)值果膠提取率(Y)的關(guān)系，其多元二次回歸方程為：Y=22.91+0.26A+ 0.50B+0.77C+0.47D+0.075AB+0.45AC-0.21AD-0.13BC-0.27BD+0.22CD-0.76A2-0.54B2-0.40C2-2.53D2。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果Table3 The results of Box-Behnken response surface design

由表4可知，該方程模型極顯著（P＜ 0.000 1 ＜0.01），模型失擬項P=0.728 3 ＞0.05，說明響應(yīng)面實驗結(jié)果與數(shù)學(xué)模型擬合良好，實驗誤差小，因此，可用該數(shù)學(xué)模型對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。其中，AB交互作用極顯著（P＜ 0.01），二次項B2因素顯著（P＜0.05），其余均不顯著，表明各因素之間的交互作用不是簡單的線性關(guān)系，其對果膠提取率的影響由大到小依次為提取時間和提取溫度不顯著且＞檸檬酸含量＞液料比。

表4 回歸方程方差分析?Table4 Variance analysis of regression equation

2.3 單因素交互作用

對各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，以考查各因素之間相互關(guān)系對果膠提取率的影響，得到響應(yīng)面曲線圖和等高線圖（圖6）。從圖6可以看出，檸檬酸含量在低水平時，加大液料比能提高果膠的提取率；檸檬酸含量在高水平時，適當(dāng)減少液料比能浸提出較多的果膠，其曲面較為平緩。同理（圖6B），在較低提取溫度范圍內(nèi)，加大液料比能提高提取率；提取溫度較高時，減少液料比同樣能浸提出較多的果膠，其曲面較為平緩。從圖6C 可以看到，在一定范圍內(nèi)可通過升高或降低提取溫度、且增加或降低檸檬酸濃度來提高果膠提取率，其曲面較為平緩。圖6D 顯示，液料比和提取時間兩個因素交互關(guān)系較強，其響應(yīng)曲面較陡，提取時間為1.5～2.0 h 及液料比為8:1～12:1（mL:g）時，提取率較高；液料比和提取時間過高或過低均會導(dǎo)致提取率下降，表明液料比和提取時間均有其適宜的水平范圍。圖6E、6F 反映提取時間和檸檬酸含量兩個因素、提取時間和提取溫度兩個因素均有較強的交互關(guān)系，兩因素之間的交互作用與提取率呈拋物線關(guān)系，其曲面較陡；在一定水平范圍內(nèi)，隨著檸檬酸含量升高且提取時間延長、提取溫度升高且提取時間延長，提取率逐漸增大，達(dá)最大值后，繼續(xù)延長提取時間、增加檸檬酸含量和提高提取溫度，果膠提取率便開始下降。

2.4 模型驗證

經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件分析，得到最佳果膠提取條件為液料比12:1(mL:g)、檸檬酸含量6.83%、提取溫度85 ℃以及提取時間1.99 h。為驗證模型的準(zhǔn)確性和有效性，且為了便于實際操作，將提取時間設(shè)置為2.0 h 進(jìn)行3 次平行實驗提取狐臭柴鮮葉果膠，實測提取率為23.32%，與理論值24.12% 相接近，實測值為理論值的96.7%，說明該模型用于優(yōu)化果膠提取條件是可行的。

2.5 狐臭柴干葉和鮮葉提取的果膠對神仙豆腐形成品質(zhì)的影響

分別用狐臭柴干葉和鮮葉提取的果膠制作神仙豆腐，通過對神仙豆腐形成品質(zhì)的比較，考察干、鮮葉果膠對神仙豆腐形成品質(zhì)的影響（圖7）。從圖7A、7B 可看出，干葉和鮮葉提取的果膠色澤不同，其中，干葉提取的果膠呈淡棕色（圖7A），鮮葉提取的果膠呈淺黃綠色，且較為鮮嫩（圖7B）。此外，分別用狐臭柴干葉和鮮葉提取的果膠制作神仙豆腐，其形成品質(zhì)具有明顯差異（圖7C、7D）。干葉果膠制作的神仙豆腐粘稠、不規(guī)則，呈黃綠色圖7C），鮮葉果膠制作的神仙豆腐外觀規(guī)則，呈翠綠色（圖7D）。這有可能是干葉中葉綠素色素經(jīng)干燥處理被分解，而鮮葉中葉綠素色素，尤其是葉綠素b 未被完全分解所致。

3 結(jié)論與討論

圖6 液料比，檸檬酸含量、提取溫度及提取時間交互作用對果膠提取率的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between ratio of liquid to material,citric acid contents,extraction temperature and time on pectin extraction rate

果膠提取方法有酸法、微波法及草酸銨提取法等[19]，曾有學(xué)者[20]用草酸銨-超聲輔助提取豆腐柴葉片果膠，提取率達(dá)63.79%。但接觸草酸銨會刺激皮膚，過度暴露將導(dǎo)致腎結(jié)石和腎損傷[23]。酸法是用稀酸將果膠水解為可溶性醛酸，再用乙醇將其沉析出來[21]，其提取方法成熟，操作簡單，成本低。其中，檸檬酸因其具有3 個解離常數(shù)不同的羧基而表現(xiàn)出較強酸性和緩沖能力，常用作飲品、點心等食品的調(diào)味劑[10]。因此，檸檬酸作為酸解質(zhì)用于提取果膠具有一定優(yōu)勢。本研究的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示，果膠提取率方程模擬效果較為合理（模型失擬項P=0.728 3 ＞0.05）。單因素實驗與響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果較為吻合，在一定的提取溫度和提取時間范圍內(nèi)，通過增加檸檬酸含量和降低液料比可使果膠的提取率增加。本研究模型的預(yù)測值與理論值較為吻合（實測值為理論值的96.7%），說明響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果具有一定的實際參考價值，且本方法提取的果膠呈鮮嫩淡黃色，其制作的神仙豆腐色澤翠綠、外觀規(guī)則，可為狐臭柴資源的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供有效途徑。此外，與目前常用于提取果膠的蘋果渣[22]相比（提取率19.65%），狐臭柴鮮葉用于提取果膠具有一定優(yōu)勢。但本研究的提取方法僅為酸法，未與其他提取方法進(jìn)行比較和交互使用，研究結(jié)果具有一定局限性，另外，本研究方法雖獲得了效果較佳狐臭柴果膠粗品，但對狐臭柴果膠的結(jié)構(gòu)、品質(zhì)、理化性質(zhì)等未做評價，其深入研究課題組尚在進(jìn)行中。

圖7 干、鮮葉果膠對神仙豆腐形成品質(zhì)的影響Fig.7 Effect of dried and fresh leaf pectin on the forming quality in fairy tofu