章旭日，白占濤，3，劉 霞，3*

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.延安大學(xué)多肽資源藥物研究中心；3.陜西省區(qū)域生物資源保育利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000)

動(dòng)物毒液是產(chǎn)毒動(dòng)物捕捉獵物和抵擋天敵的重要工具，其成分復(fù)雜，其中的有效成分即毒素通常是肽和小分子化合物。肽類毒素具有不同的氨基酸序列、多肽長(zhǎng)度、二硫鍵及折疊模式，通常由20到70個(gè)氨基酸殘基、2到4對(duì)二硫鍵組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。毒素能靶向作用于各類離子通道而影響其正常運(yùn)作。根據(jù)作用于通道上的方式，毒素分為孔區(qū)阻滯劑毒素和門(mén)控調(diào)節(jié)劑毒素，蝎毒素多肽屬于門(mén)控調(diào)節(jié)劑毒素，能夠與鈉通道結(jié)合影響其門(mén)控特性，因此是研究靶向鈉通道藥物很好的工具。

研究普遍認(rèn)為，蝎毒素多肽主要與通道上的VSD(Voltage-sensing Domain)結(jié)合而影響其門(mén)控特性，但二者結(jié)合的詳細(xì)分子結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制目前尚不明確。近來(lái)，顏寧組利用高分辨冷凍電鏡發(fā)現(xiàn)，同為門(mén)控調(diào)節(jié)劑的蜘蛛毒素Dc1a除與VSD結(jié)合外，還與細(xì)胞外環(huán)(連接著孔螺旋P2和孔區(qū)域中的S6區(qū)段)有結(jié)合點(diǎn)。正是基于這一新發(fā)現(xiàn)的提示以及目前該領(lǐng)域研究的諸多疑問(wèn)，本文通過(guò)聚焦蝎毒素多肽與鈉通道特異性結(jié)合位點(diǎn)研究的新進(jìn)展，為該領(lǐng)域研究提出新思路和可供借鑒的一些參考。

1 蝎毒素

蝎毒素由20至70個(gè)氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)特征在于每個(gè)α螺旋通過(guò)2對(duì)二硫鍵與反向平行β折疊連接，在N端具三維結(jié)構(gòu)，或一個(gè)延伸結(jié)構(gòu)，或β片層[1]。蝎毒素的分類方法很多，根據(jù)不同的作用機(jī)制可分為神經(jīng)毒素和細(xì)胞毒素；根據(jù)作用的對(duì)象，它分為哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)毒素；它還可以根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量分為長(zhǎng)鏈和短鏈蝎毒素，長(zhǎng)鏈蝎毒素含有60到70個(gè)氨基酸殘基。4對(duì)二硫鍵，主要作用于興奮性細(xì)胞的鈉通道；短鏈蝎毒素含20到40個(gè)氨基酸殘基，3至4對(duì)二硫鍵，并且可以特異性作用于鉀通道、氯通道和鈣通道。不同類型蝎毒素多肽的結(jié)構(gòu)和作用位點(diǎn)是不同的，因此根據(jù)蝎毒素的藥理學(xué)和電生理學(xué)特性，將蝎毒素分為α蝎毒素和β蝎毒素兩種，α蝎毒素作用在鈉通道上位點(diǎn)3，減慢鈉通道的失活過(guò)程，延長(zhǎng)鈉通道的開(kāi)放時(shí)間；β蝎毒素對(duì)鈉通道位點(diǎn)4的作用是影響鈉通道的激活過(guò)程，激活相電壓向超極化方向移動(dòng)，對(duì)鈉通道的失活無(wú)影響[2]。

2 鈉離子通道

鈉通道在產(chǎn)生膜興奮性中起關(guān)鍵作用，并且是神經(jīng)毒素的常見(jiàn)靶點(diǎn)。鈉通道由一個(gè)α亞基(260 kD)，一個(gè)或數(shù)個(gè)β亞基(33～36 kD)組成[3，4]。α亞基是鈉通道的功能性亞基，由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成(DomainⅠ～DomainⅣ，DⅠ～DⅣ)，每個(gè)Domain含有六個(gè)跨膜片段(S1～S6)。這些結(jié)構(gòu)相似但不相同的結(jié)構(gòu)域由S1～S4電壓敏感區(qū)組成，S4片段中每3個(gè)氨基酸殘基中就有一個(gè)帶正電的氨基酸。中間間隔2個(gè)疏水性氨基酸，其中正電荷氨基酸對(duì)膜電位變化產(chǎn)生反應(yīng)，使通道產(chǎn)生開(kāi)放或者關(guān)閉的構(gòu)象。S5～S6則與每個(gè)結(jié)構(gòu)域螺旋形排列在一起，在膜中形成鈉離子選擇孔。在哺乳動(dòng)物中，鈉通道根據(jù)α亞基結(jié)構(gòu)的不同，可分為Nav1.1～Nav1.9和Nax十個(gè)亞型。其中亞型Nav1.1～Nav1.3和Nav1.6分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Nav1.4、Nav1.5分布在肌肉組織中。Nav1.7～Nav1.9分布在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)[5]。不同的鈉通道亞型具有相似的結(jié)構(gòu)但功能不同。還可以根據(jù)其對(duì)河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是否敏感，鈉通道亞型可以分為T(mén)TX敏感型(TTX-S)和TTX不敏感型(TTX-R)[6，7]，其中Nav1.1～Nav1.4、Nav1.6、Nav1.7屬于TTX-S，并且納摩爾濃度的TTX就能夠抑制TTX敏感型，而TTX不敏感型只對(duì)微摩爾濃度的TTX具有反應(yīng)[8]。離子通道和小分子配體組合調(diào)控通道開(kāi)放或者關(guān)閉，從而控制鈉離子的滲透性。其中鈉通道在生理調(diào)控中起關(guān)鍵作用，因?yàn)槠鋸V泛分布表達(dá)在各種神經(jīng)元中，當(dāng)膜去極化達(dá)到閾電位，鈉通道打開(kāi)形成動(dòng)作電位。因此，鈉通道是神經(jīng)系統(tǒng)正常運(yùn)作的基礎(chǔ)。如果鈉通道被抑制，則不能形成動(dòng)作電位，神經(jīng)系統(tǒng)就將處于癱瘓狀態(tài)。

3 蝎毒素與鈉離子通道的互作機(jī)制

動(dòng)物毒素能夠與離子通道結(jié)合改變離子通道的開(kāi)啟或關(guān)閉，從而使獵物喪失抵御捕食者的能力。通常，改變電壓門(mén)控離子通道功能的毒素通過(guò)兩種機(jī)制起作用：一種是孔區(qū)阻滯劑，它是一種小分子神經(jīng)毒素，如河豚毒素(TTX)和石房蛤毒素(STX)。它們主要通過(guò)與鈉通道的孔區(qū)結(jié)合從而堵塞孔道，直接阻止了鈉離子的通透；另一種是門(mén)控調(diào)節(jié)劑，它們通過(guò)與通道的電壓感受域(voltage-sensing domain，VSD)結(jié)合[9]，改變通道構(gòu)象，使通道開(kāi)啟或失活而影響門(mén)控效應(yīng)。門(mén)控調(diào)節(jié)劑通常比孔區(qū)阻斷劑具有更高的選擇性，所以門(mén)控調(diào)節(jié)劑是研究VSD在通道激活和失活過(guò)程中復(fù)雜構(gòu)象變化的有力工具，這也是鈉通道亞型選擇性藥物開(kāi)發(fā)的重要線索[10]。關(guān)于通道毒素與鈉通道互作分子機(jī)制的相關(guān)報(bào)道很多，但沒(méi)有得出它們相互作用的共識(shí)模型。早期研究表明，在門(mén)控調(diào)節(jié)劑與鈉通道結(jié)合中，細(xì)胞外S3～S4環(huán)起到主導(dǎo)作用[11]，但隨后的研究揭示S1～S2環(huán)在許多門(mén)控調(diào)節(jié)劑相互作用中的關(guān)鍵作用[12]。特別是近年研究表明，門(mén)控調(diào)節(jié)劑毒素之所以能夠影響通道的門(mén)控是因?yàn)樵摱舅亟Y(jié)合在S1～S4螺旋細(xì)胞外的空腔中，就像一個(gè)楔形物阻礙了電壓傳感器的運(yùn)動(dòng)[13]。所以有人提出，大的門(mén)控調(diào)節(jié)劑毒素，如蝎毒素，可能同時(shí)結(jié)合VSD和細(xì)胞外環(huán)(連接著孔螺旋P2和孔區(qū)域中的S6區(qū)段)[14]，但迄今并沒(méi)有研究證實(shí)膜孔結(jié)構(gòu)域螺旋與門(mén)控調(diào)節(jié)劑結(jié)合中的精確機(jī)制。所以，理解和闡明毒素對(duì)電壓門(mén)控鈉離子通道調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)至關(guān)重要。

3.1鈉通道神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)3

鈉通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)3主要位于鈉通道DⅣ的S1～S2胞外環(huán)和S3～S4胞外環(huán)，以及DⅠ的S5～S6的胞外環(huán)，被α-蝎毒素、海葵毒素和一些蜘蛛毒素占據(jù)，能夠延緩或阻止鈉通道的失活，誘導(dǎo)鈉通道長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放[15，16]。α-蝎毒素是一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽神經(jīng)毒素，每種都含有60到70個(gè)氨基酸殘基，通過(guò)4個(gè)二硫鍵交聯(lián)[17，18]。α-蝎毒素能夠識(shí)別哺乳動(dòng)物鈉通道上的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)3，通過(guò)大鼠腦鈉通道上結(jié)合位點(diǎn)3與α-蝎毒素的結(jié)合力變化研究發(fā)現(xiàn)其結(jié)合力會(huì)因?yàn)橥ǖ廊O化而降低，說(shuō)明α-蝎毒素與位點(diǎn)3結(jié)合的電壓依賴性與通道激活的電壓依賴性密切相關(guān)[18，19]。并且毒素對(duì)通道失活的特異性作用表明，毒素與位點(diǎn)3結(jié)合后，改變了位點(diǎn)3的構(gòu)象，阻止了通道的快速失活[20]。

通過(guò)光親和標(biāo)記、蛋白酶裂解、序列特異性抗體進(jìn)行抗體定位以及與序列特異性抗體的結(jié)合阻斷等方法對(duì)受體位點(diǎn)3的定位研究表明，α亞基DⅠ和DⅣ中的跨膜片段S5和S6之間的細(xì)胞外環(huán)參與了α-蝎毒素與位點(diǎn)3的結(jié)合。通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，Nav1.2DⅣS1～S2胞外連接環(huán)上的T1560和S3～S4胞外連接環(huán)上的E1613以及S3跨膜片段上的F1610組成了Lqh2毒素與鈉通道相互結(jié)合的高親和位點(diǎn)，而在DI孔道區(qū)上的T393是Lqh2毒素的一個(gè)低親和結(jié)合位點(diǎn)[21]。鈉通道神經(jīng)毒素受體位點(diǎn)3位于DⅣ中S4的細(xì)胞外側(cè)[22]，S4段作為電壓傳感器，其序列中包含4～7個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基，當(dāng)膜去極化時(shí)，在電場(chǎng)影響下向外移動(dòng)，引起通道的激活[23]。α-蝎毒素通過(guò)與S4片段胞外環(huán)的氨基酸結(jié)合，阻礙了結(jié)構(gòu)域DⅣS4的運(yùn)動(dòng)，這改變了通道失活所必需的構(gòu)象變化，最終延緩了通道的失活。這種毒素傳感器捕獲模型對(duì)門(mén)控修飾毒素具有廣泛的適用性[24]。利用分子模擬實(shí)驗(yàn)，推測(cè)α-蝎毒素與鈉通道相互作用的模型，在這個(gè)模型中，α-蝎毒素就像一個(gè)楔型物插入到DⅣ的S1～S2和S3～S4兩個(gè)胞外連接環(huán)之間的縫隙中與通道發(fā)生相互作用。

3.2 鈉通道神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)4

鈉通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)4主要位于鈉通道DⅡ上S1～S2和S3～S4的胞外環(huán)以及DⅢ的孔道區(qū)。β-蝎毒素占據(jù)鈉通道的神經(jīng)毒素結(jié)合位點(diǎn)4，由4個(gè)二硫鍵交聯(lián)，含60到65個(gè)氨基酸殘基[25]，它通過(guò)改變鈉通道的門(mén)控特性起作用。β-蝎毒素誘導(dǎo)電壓依賴性鈉通道向超極化方向移動(dòng)和鈉電流峰值的降低[26，27]。

Marcotte利用嵌合鈉通道定位受體位點(diǎn)4，分析β-蝎毒素在嵌合鈉通道上的活性。該嵌合鈉通道具有來(lái)自心臟和骨骼肌或腦鈉通道的結(jié)合域[28]。通過(guò)對(duì)通道上位點(diǎn)的突變和結(jié)構(gòu)域取代的研究，發(fā)現(xiàn)在DⅡS1～S2上突變779位點(diǎn)的Glu或在DⅡS3～S4上突變837位點(diǎn)的Glu、840位點(diǎn)的Leu和845位點(diǎn)的Gly可使Css4對(duì)rNav1.2a不敏感[29]，用來(lái)自果蠅通道DmNav1的等效結(jié)構(gòu)域替換rNav1.2a中的DⅡ可使AahIT對(duì)rNav1.2a不敏感[30]，表明DⅡ是必需的。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦鈉通道受體位點(diǎn)G845N的單個(gè)氨基酸殘基突變形成的嵌合體對(duì)毒素的親和力顯著降低且通道激活的電壓依賴性沒(méi)有向超極化偏移，說(shuō)明G845N可以改變?chǔ)?蝎毒素的電生理效應(yīng)。因此，毒素與受體位點(diǎn)的高親和性必須依賴于被激活的受體位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。β-蝎毒素通過(guò)與S3～S4環(huán)的結(jié)合從而與激活狀態(tài)下的鈉通道DⅡS4片段的胞外末端相互作用。由于DⅡS4片段在去極化過(guò)程中向外移動(dòng)，通過(guò)與DⅡS4片段胞外末端的結(jié)合，β-蝎毒素捕獲了處于外部激活位置的DⅡS4片段，并將其固定，從而使得在面對(duì)后續(xù)去極化時(shí)加強(qiáng)了通道的激活，同時(shí)，激活的電壓依賴性向超極化移動(dòng)[31]。

β-蝎毒素是大分子配體，與α-蝎毒素類似，在DⅡS3～S4具有結(jié)合位點(diǎn)，與鈉通道的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可能還有額外的結(jié)合點(diǎn)[25]。這方面的第一個(gè)證據(jù)是來(lái)自于Tityuszulianus的β-蝎毒素Tz1與通道相互作用的特異性研究，其中證實(shí)位于DⅢ孔道域C末端胞外環(huán)上的3個(gè)氨基酸殘基決定了β-蝎毒素對(duì)不同亞型鈉通道的作用[32]。另一證據(jù)是顏寧組利用高分辨冷凍電鏡成像，解析了來(lái)自美洲小蠊的NavPaS鈉通道及其阻斷劑TTX/STX和其門(mén)控調(diào)節(jié)劑Dc1a的復(fù)合物結(jié)構(gòu)[33]。Dc1a是一種來(lái)自沙漠灌木蜘蛛Diguetia的毒素，與β-蝎毒素相似，可以識(shí)別鈉通道受體位點(diǎn)4，是一種門(mén)控修飾劑，它們使昆蟲(chóng)麻痹，對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)毒，Dc1a可以促進(jìn)德國(guó)蟑螂電壓門(mén)控鈉通道(BgNav1)的開(kāi)放，對(duì)人類鈉通道不敏感[34]。冷凍電鏡結(jié)果表明Dc1a是與美洲小蠊NavPaS鈉通道第二個(gè)VSD結(jié)合，結(jié)合后毒素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。由于毒素的第三與第四β折疊之間的環(huán)插入到VSD的近細(xì)胞外側(cè)，它們兩者之間形成很多氫鍵和范德華力，這些氫鍵和范德華力把VSD固定在激活狀態(tài)，激活通道。該研究得到了高分辨率的毒素-通道復(fù)合物結(jié)構(gòu)，可以清晰地看到TTX/STX與美洲小蠊的NavPaS鈉通道的結(jié)合構(gòu)象。該研究中發(fā)現(xiàn)TTX與STX在鈉通道孔區(qū)與孔區(qū)選擇性濾器域SF形成大量氫鍵，使SF堵在孔區(qū)，阻止了鈉離子通過(guò)SF[33]。實(shí)驗(yàn)表明，門(mén)控修飾劑Dc1a能夠同時(shí)結(jié)合VSD和孔道域螺旋發(fā)揮毒性，這類毒素有比先前認(rèn)知的更復(fù)雜的毒性機(jī)制。

4 展望

蝎毒素多肽與鈉通道的結(jié)合能夠改變通道的門(mén)控特性，調(diào)控機(jī)體的生理過(guò)程。雖然兩者之間的作用模式早已掌握，但由于鈉通道的復(fù)雜性，對(duì)于兩者間的精確作用機(jī)制尚不明確。隨著計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)的快速發(fā)展，我們將有能力進(jìn)一步研究毒素與通道的精確作用機(jī)制，為理解蝎毒素多肽等門(mén)控修飾毒素的分子探針作用及以鈉通道為作用靶點(diǎn)的藥物研究、篩選、設(shè)計(jì)乃至開(kāi)發(fā)利用提供參考。