牛俊軻 盧寶慧 劉麗萍 李萌 王田 高潔

摘 ?要：為明確吉林省和黑龍江省煙草赤星病病原菌的種類，對吉林省15個煙區(qū)和黑龍江省7個煙區(qū)的煙草赤星病病原菌進行了分離鑒定，共分離獲得312株致病菌株。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，共鑒定出4種鏈格孢屬真菌，其中鏈格孢（Alternaria alternata）230株，細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）78株，鴨梨鏈格孢（Alternaria yaliinficiens）2株，長柄鏈格孢（Alternaria longipes）2株。其中吉林省煙區(qū)鑒定出了鏈格孢、細(xì)極鏈格孢和鴨梨鏈格孢3種，黑龍江省煙區(qū)鑒定出了長柄鏈格孢、鏈格孢和細(xì)極鏈格孢3種。兩個省區(qū)的優(yōu)勢種均為鏈格孢。此外，本試驗利用5種基因序列片段（ITS、GDP、ACT、EF、RPB2）進行煙草赤星病菌的分子生物學(xué)鑒定，其中GDP基因僅能鑒定出鏈格孢和細(xì)極鏈格孢2種，RPB2基因能鑒定出4種鏈格孢，而ITS、EF、ACT基因序列比較保守，不適合區(qū)分這些鏈格孢種。本研究明確了吉林省和黑龍江省煙區(qū)引起煙草赤星病的病原菌種類，為下一步的定向防控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草;赤星病;鏈格孢屬;形態(tài)學(xué);分子生物學(xué)

中圖分類號：S435.72 ?????????文章編號：1007-5119（2019）05-0052-08 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.05.008

Abstract：In order to clarify the types of pathogens causing?tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces， this study isolated and identified pathogens of tobacco brown spot disease from 15 major tobacco producing areas?in Jilin Province and 7 major tobacco producing areas in Heilongjiang Province. A total of 312 pathogenic strains were isolated and identified. Four species ofAlternariawere identified through morphological and molecular biological identification， including 230 strains ofAlternaria alternata， 78 strains ofAlternaria tenuissima， 2 strains ofAlternaria yaliinficiens， and?2 strains ofAlternaria longipes.A. alternata，A. tenuissimaandA. yaliinficienswere identified in Jilin Province?andA. longipes，A. alternataandA. tenuissimawere identified in Heilongjiang Province.A. alternateand?A. tenuissimawere both identified in the two Province andA. alternatawas the dominant species in both Province. In addition， five gene sequence fragments （ITS， GDP， ACT， EF， RPB2） were used for molecular biological identification in this study， in which the GDP gene can only identifyA. alternataandA. tenuissima， RPB2 gene can identify all four species ofAlternaria， while ITS， EF， ACT gene sequences are more conservative. So ITS， EF and ACT gene sequences are not suitable for distinguishing the various species ofAlternaria. Through this study， the types of pathogens causing tobacco brown spot disease in Jilin Province and Heilongjiang Province were identified， which laid the foundation for the next stage of targeted prevention and control.

Keywords：tobacco; brown spot disease;Alternaria; morphology; molecular biology

煙草赤星病是由無性孢子類鏈格孢屬真菌引起的煙葉成熟后期重要的葉部真菌性病害，有間歇性和爆發(fā)性發(fā)生的特點，病害嚴(yán)重時煙葉發(fā)病率可高達90%，使烤煙質(zhì)量下降1～2個等級，重病區(qū)減產(chǎn)減值達50%以上，已成為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙的主要障礙^[3]。該病在世界各地?zé)焻^(qū)均有發(fā)生，且發(fā)生有明顯的階段性，苗期至旺長期很少發(fā)生，現(xiàn)蕾后赤星病開始出現(xiàn)，煙葉進入成熟階段亦即進入了赤星病易感病階段。煙葉成熟早、成熟度好，赤星病也相應(yīng)發(fā)生的早而重^[1-2]。

目前，我國對煙草赤星病菌的鑒定是以形態(tài)學(xué)鑒定為主，分子生物學(xué)鑒定為輔的方式。如成巨龍等^[3]、祖燕青等^[4]和關(guān)博元等^[5]分別用形態(tài)學(xué)的方法對陜西、河南、重慶等地的煙草赤星病菌進行鑒定，沒有用分子生物學(xué)進行驗證，其中成巨龍等^[3]鑒定出陜西省的煙草赤星病菌有鏈格孢（A. alternata）和煙草鏈格孢（A. nicotianae）;祖燕青等^[4]鑒定出河南省的煙草赤星病菌有鏈格孢（A. alternata）、細(xì)極鏈格孢（A. tenuissima）、鴨梨鏈格孢（A. yaliinficiens）、長柄鏈格孢（A. longipes）和一個未知種;關(guān)博元等^[5]鑒定出重慶市的煙草赤星病菌只有鏈格孢（A. alternata）一種。胡中會等^[6]對云南省煙草赤星病菌進行rDNA-ITS序列分析，結(jié)果表明rDNA-ITS基因序列過于保守，不適合進行煙草赤星病菌種的鑒定。已有研究^[7-10]通過形態(tài)學(xué)或分子生物學(xué)兩種方法分別對重慶、貴州、湖北、山東等地的煙草赤星病菌進行了鑒定，但所用ITS基因序列均不能很好地區(qū)分各個種，僅能進行鏈格孢屬水平的鑒定。以上結(jié)果表明不同?。ㄊ?、區(qū)）煙草赤星病菌種類不盡相同，但優(yōu)勢種主要為A. alternata，且鑒定結(jié)果都是形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果，沒有發(fā)現(xiàn)有效區(qū)分Alternaria多個種的基因序列。

目前，尚沒有針對吉林省和黑龍江省煙草赤星病病原菌種類的系統(tǒng)研究。因此，故本試驗采用形態(tài)學(xué)和多基因序列（ITS、GDP、ACT、EF、RPB2）兩種方法進行鑒定，旨在探明吉林省和黑龍江省內(nèi)各煙區(qū)煙草赤星病病原菌的種類及分布，以期為該病害的系統(tǒng)防治奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1??煙草赤星病病樣采集

2017年從吉林省15個煙區(qū)和黑龍江省7個煙區(qū)進行病害標(biāo)本采集，并對采集到的病害標(biāo)本進行拍照和編號，記錄采集的時間、地點和發(fā)病特征。

1.2??試驗培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200?g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1000?mL）;PCA培養(yǎng)基（馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂15 g，水1000?mL）;水瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂15 g，水1000?mL）。其中葡萄糖、瓊脂、分子生物學(xué)試劑藥品以及引物合成均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3??病原菌的分離和保存

采用組織分離法進行煙草赤星病菌的分離，首先在病健交界處切下病組織，放入75%酒精消毒30 s，然后轉(zhuǎn)入3%?NaClO消毒2 min，用無菌水清洗3次，保證表面雜菌清洗干凈，然后放在無菌操作臺中吹干，再用無菌剪刀將組織剪成約0.5 cm²大小的小塊，分別放在PDA培養(yǎng)基平板上，在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待病原菌產(chǎn)孢后采用單孢分離法進行煙草赤星病菌的純化。取初分離的培養(yǎng)菌絲置于加入無菌水的離心管中振蕩，分離菌絲上的孢子，取1 μL進行鏡檢，并調(diào)整其濃度。在PDA平板上加入20 μL已配制好的孢子懸浮液，涂板后于25 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)平板上形成單個菌落時，挑取菌落轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上培養(yǎng)以獲得分離物的純培養(yǎng)，純化的菌種于4 ℃保存?zhèn)溆?sup>[11-13]。

1.4 ?致病性測定

用盆栽的方法進行煙草品種云87的種植，常規(guī)管理至15片真葉展開后，選擇中下部健康煙葉進行活體接種。將單孢分離菌株轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后，在菌落邊緣打取直徑為8 mm的菌絲塊，采用傷口接種法接種到健康煙葉上，并用脫脂棉進行保濕，無菌的瓊脂塊接種作為對照，每個菌株3個重復(fù)，每個重復(fù)接種3個葉片，5 d后觀察發(fā)病情況。

1.5 ?煙草赤星病菌孢子形態(tài)和產(chǎn)孢表型觀察

對分離得到的病原菌，觀察其在PDA固體培養(yǎng)基和PCA固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀，包括菌落的形狀、大小、顏色等，觀察菌絲、分生孢子、產(chǎn)孢表型及分生孢子梗的形態(tài)特征，并測量大小，進

行顯微拍照等。然后根據(jù)病組織的癥狀，結(jié)合病原菌形態(tài)特征進行病原菌鑒定^[14-16]。

1.6 ?煙草赤星病菌分子生物學(xué)鑒定

單孢菌株在PDA平板上培養(yǎng)5～7 d后，采用CTAB法提取致病菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，用ITS4（5?-TCCTCCCGCTTATTGAT ATGC-3?）和ITS5（5?-GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-3?），GDP-1（5?-CAACGGCTTCGGTCG CATTG-3?）和GDP-2（5?-GCCAAGCAGTTGGTTG TGC-3?），ACT-512F（5?-TATCGTTCTCGACTCTGG TGAC-3?）和ACT-783R（5?-TCTGCATACGGTCG GAGATAC-3?），EF1-728F（5?-CATCGAGAAG TTCGAGAAGG-3?）和EF1-986R（5?-TACTTGAA GGAACCCTTACC-3?），RPB2-5F2（5?-GGGGWGA YCAGAAGAAGGC-3?）和RPB2-7CR（5?-CCCAT RGCTTGTYYRCCCAT-3?）5對引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系均為50 μL，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增好的產(chǎn)物由上海生物工程有限公司進行序列測定^[17]。將供試菌株測序結(jié)果序列在NCBI上采用BLAST比對分析，并在GenBank中下載相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，使用Clustal X軟件進行多重序列比對，然后將得到的比對結(jié)果使用在線軟件Boxshade （http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）進行格式化，得到多重序列比對結(jié)果。將上述獲得的多重序列比對結(jié)果導(dǎo)入MEGA 5.10 軟件中，使用鄰接法（neighbor-joining methods，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

本試驗在形態(tài)學(xué)鑒定過程中，認(rèn)為在分生孢子和分生孢子梗形態(tài)相似的情況下，產(chǎn)孢表型的差別更加明顯，在產(chǎn)孢表型的基礎(chǔ)上結(jié)合分生孢子的形態(tài)、大小、橫隔數(shù)、縱隔數(shù)等因素綜合分析，從而完成形態(tài)學(xué)鑒定。在多基因分子鑒定中表明，ITS、EF、ACT基因序列保守，不適合進行鏈格孢種的鑒定，這與祖燕青等^[4]、胡中會等^[6]報道的結(jié)果一致，GPD基因序列相對保守，僅能區(qū)分A. alternata和A. tenuissima兩種鏈格孢，但證明了RPB2基因在鏈格孢種間的序列差異明顯，可進行Alternaria屬下這4種鏈格孢種的區(qū)分，能作為煙草赤星病不同種的輔助鑒定。

本研究在煙草赤星病的病樣采集中，吉林省采集的煙區(qū)涉及15個地點，基本覆蓋了吉林省的所有煙草生產(chǎn)市縣，黑龍江省共采集7個地點，雖然覆蓋到了主要煙草產(chǎn)區(qū)，但由于黑龍江省煙草產(chǎn)區(qū)面積較大，故黑龍江省的煙草赤星病病樣還應(yīng)進一步采集鑒定。本試驗分離得到的A. yaliinficiens和A. longipes菌株數(shù)量太少，可能與采樣區(qū)域和數(shù)量有關(guān)，故應(yīng)該在兩省范圍內(nèi)繼續(xù)采集煙草赤星病樣，為煙草赤星病各個種病狀的完善提供依據(jù)。

4 ?結(jié)??論

本研究通過形態(tài)學(xué)和多基因分子序列對吉林省和黑龍江省的煙草赤星病病原菌進行鑒定，明確了吉林省和黑龍江省煙草赤星病菌的優(yōu)勢種均為A. alternata，其次是A. tenuissima，另外在吉林省白城市洮北區(qū)和吉林省延吉市發(fā)現(xiàn)A. yaliinficiens，而A.longipes只是在黑龍江省肇州縣永勝鄉(xiāng)和黑龍江省哈爾濱市寧遠(yuǎn)鎮(zhèn)有分布。證實了RPB2基因序列可以用來鑒定煙草赤星病病原。本試驗為進一步研究煙草赤星病發(fā)生規(guī)律及致病機制奠定了基礎(chǔ)，今后應(yīng)進一步擴大取樣范圍，完善研究結(jié)果，為兩省更有針對性地防治赤星病提供依據(jù)。

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