張應(yīng)剛，鄧 宇

(農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

濃香型白酒是指以高粱、大米、玉米等糧谷為原料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，具有以己酸乙酯為主體香的白酒。濃香型白酒的風(fēng)格特征主要為“窖香濃郁，綿甜醇厚，香味協(xié)調(diào)，回味悠長”[1]，其產(chǎn)量占據(jù)了我國每年白酒總產(chǎn)量的70%以上[2]。濃香型白酒的香氣成分主要來源與大曲微生物、糟醅微生物、窖泥微生物以及生產(chǎn)環(huán)境中微生物代謝產(chǎn)生，其中濃香型白酒中的窖香主要來源于窖泥微生物產(chǎn)生[3]。窖泥作為濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物棲息的主要生態(tài)環(huán)境之一，常年處于低pH值、高水分、高靜壓、兼性厭氧的窖池中，這給窖泥微生物的生長、優(yōu)化提供了特殊的棲息環(huán)境[4]。

近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們大量利用DGGE指紋圖譜技術(shù)[5]、熒光定量PCR[6-8]、,16S rRNA基因克隆測序和高通量測序技術(shù)等多種技術(shù)手段[9-11]對不同產(chǎn)區(qū)、同一窖泥的不同位置以及不同窖齡的窖泥微生物進(jìn)行微生物多樣性和生態(tài)學(xué)研究。不同窖齡、不同產(chǎn)區(qū)以及同一產(chǎn)區(qū)的環(huán)境因子與微生物的群落結(jié)構(gòu)有明顯不同[12-14]，這些不同能夠影響窖泥中的微生物的相互作用關(guān)系，也能影響濃香型白酒的香味物質(zhì)成分和含量。本章通過利用高通量測序技術(shù)對不同窖齡窖泥樣品(5年、25年、70年)進(jìn)行分析，進(jìn)一步的了解不同窖齡窖泥細(xì)菌和古菌的微生物的組成和微生物多樣性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料(只標(biāo)注主要的)：四川成都某酒廠不同窖齡窖泥樣品(5年、25年、70年)；QIAGEN PowerSoil?DNA Isolation Kit，German；無水乙醇，化學(xué)純，國藥；Na2HPO4,KH2PO4,NaCl,KCl，SIGMA-ALDRICH。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌鍋：Hirayama；Centrifuge 5418 臺式離心機(jī)：eppendorf；PowerPac 電泳儀：Bio-Rad；QL-901 微型漩渦混合器：江蘇南海市某儀器制造有限公司；GL150 金屬?。航K南海市某儀器制造有限公司；LX-200 手掌型離心機(jī)：江蘇南海某儀器制造有限公司；NanoDrop ND-1000 微量紫外可見分光光度計：Nanodrop。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

窖泥樣品的DNA的提取采用QIAGEN PowerSoil?DNA Isolation Kit，具體的實(shí)驗(yàn)步驟參見說明書。對提取的DNA純度和濃度檢測利用nano測定儀進(jìn)行測定，直接讀出DNA的濃度，主要對260 nm，280 nm處的吸光值進(jìn)行分析，以A260/A280的比值作DNA純度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 PCR擴(kuò)增以及高通量測序

用檢測后的合格的基因組DNA稀釋后作為模板，PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌16S V3+V4可變區(qū)的引物341F (5’-CCTAYGGGRBCGASCAG-3’)和806R (5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)，古菌的V4+V5的可變區(qū)的引物519F (5’-CAGCCGCCGCCGCGGTAA-3’)和915R (5’-GTGCTCCCCCGCCAATT CCT-3’),并且使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs 公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性1 min;30個循環(huán)包括(98 ℃變性10 sec;50 ℃退火30 sec;72 ℃擴(kuò)增30 sec)；72 ℃再延伸5 min。采用Bio-rad T100 梯度PCR 儀擴(kuò)增，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，割膠回收目標(biāo)條帶。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，合格后，使用HiSeq進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用Cutadapt軟件過濾和按barcode拆分樣本后，進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性計算、Venn圖和花瓣圖等分析，得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。另一方面，對OTUs進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并進(jìn)一步得到不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異，通過PCoA和PCA,NMDS等降維圖和樣品聚類樹進(jìn)行展示。通過Simper定量分析物種對組間差異的貢獻(xiàn)度。為進(jìn)一步挖掘分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異，選用T-test,MetaStat,LEfSe,Anosim和MRPP等統(tǒng)計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣品微生物多樣性分析

對3個不同窖齡的窖泥的OUT數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行比較分析(見表1)，在5年,25年，70年3個不同年代的窖池窖泥中分別檢測到507，443，530個細(xì)菌OUT和19，15，17個古菌OUT，隨著窖齡的增加，窖泥微生物的OUT數(shù)呈現(xiàn)一個先降低再增加的趨勢。

在不同的窖齡的窖池中，菌群的shannon index有比較明顯的差異，并與窖齡的變化趨勢呈負(fù)相關(guān)，隨著窖齡的增加，窖泥的細(xì)菌和古菌多樣性降低。而從chao 1數(shù)據(jù)來看，隨著窖泥窖齡的增加，窖泥中細(xì)菌的總物種數(shù)增加，古菌的總物種數(shù)先降低后增加。窖泥在經(jīng)過長時間的周期性的開窖、封窖發(fā)酵的周期性過程，窖泥中的物種多樣性降低，細(xì)菌的總物種數(shù)有一定的增加，古菌的總物種數(shù)會降低而后輕微增加。這跟鄧杰[15-16]、施思[4]等結(jié)果有差異。新窖泥中含有很多雜菌，隨著窖泥老化過程的進(jìn)行，雜菌減少，微生物多樣性降低，而適應(yīng)窖泥環(huán)境的優(yōu)勢物種被大量富集。老窖出好酒，老窖釀造的濃香型白酒香氣成分協(xié)調(diào)，本結(jié)果表明隨著窖泥的長時間的馴化，優(yōu)勢細(xì)菌的富集可能跟窖泥質(zhì)量和白酒香氣成分的種類和含量有密切的聯(lián)系。

表1 不同窖齡窖泥的細(xì)菌和古菌群落多樣性指數(shù)

2.2 Beta 多樣性

根據(jù)聚類分析顯示，細(xì)菌的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了22.1%和14.4%(見圖1)。3個不同窖齡窖泥的細(xì)菌均分布在PC1和PC2的區(qū)域內(nèi)，并且每個年代窖泥樣品的細(xì)菌很好的集中在一個簇，3個年代窖泥的細(xì)菌分布在3個不同的簇中。古菌的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別達(dá)到了29.3%和15.33%(見圖2)。同樣的，不同窖齡窖泥的古菌分布在3個不同的簇中，并且相對集中。結(jié)果表明同意窖齡窖泥的微生物能夠很好的集中在一個簇中，組內(nèi)群落結(jié)構(gòu)相似。不同窖齡窖泥的微生物分布在不同的3個簇中，組間的主成分差異顯著，細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)跟窖泥的窖齡有顯著的關(guān)系。

圖1 細(xì)菌群落的主成分分析

圖2 古菌群落的主成分分析(3D-PCA)

2.3 細(xì)菌群落分布特征分析

2.3.1 不同窖齡窖泥細(xì)菌群落在門水平上的組成

基于16s高通量測序的序列數(shù)據(jù)分析表明，3個不同年代，15個窖泥樣品中細(xì)菌主要分布在28個門，40個綱，86個目，159個科和349個屬。這些細(xì)菌主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Cloacimonetes、放線菌門(Actinobacteria)、柔膜菌門(Tenericutes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、生氧光細(xì)菌門(Oxyphotobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和 Armatimonadetes等多個門類。在5年窖齡窖泥中，占優(yōu)勢的微生物主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，其相對豐度分別為53.17%，41.89%和3.6%。在25年窖齡窖泥中，占優(yōu)勢的物種主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和Cloacimonetes，相對豐度分別為70.88%，22.91%和3.86%。而在70年窖齡窖泥中，主要的微生物分布在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，相對豐度分別為88.75%，4.14%和2.77%(見圖3)。

結(jié)果表明，從門的分類水平來看，伴隨著窖泥老化的過程，厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度增加，相對豐度從53.17%增加到88.75%。在5年窖齡窖泥中占有非常高的豐度的變形桿菌門(Proteobacteria)隨著窖泥老化的過程，相對豐度降低，在25年和70年豐度僅僅只有0.56%和0.9%。在窖泥中，變形桿菌門(Proteobacteria)隨著時間的增長，逐漸被淘汰。而在25年中相對豐度較高的擬桿菌門(Bacteroidetes)，在窖泥老化的前期相對豐度有很明顯的富集，伴隨著窖泥的老化完成，在70年窖泥中，相對豐度逐漸變化為4.14%。窖泥的老化主要是厚壁菌門(Firmicutes)不斷富集的過程。

圖3 不同窖齡樣品細(xì)菌門水平分布

2.3.2 不同窖齡窖泥細(xì)菌群落在屬水平上的組成

為了對不同窖齡窖泥功能微生物的變化進(jìn)一步的分析，對3個年代的樣品的細(xì)菌的相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，在3個不同窖齡窖泥樣品中，主要的優(yōu)勢物種為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)、阿姆莫利菌屬(Ampullimonas)、三角菌屬(Petrimonas)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、Anaerocella、產(chǎn)乙酸嗜蛋白菌屬(Proteiniphilum)、曲桿菌屬(Curvibacter)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)(見圖4)，這些微生物主要代謝產(chǎn)生乙酸、丁酸、乳酸、乙醇、己酸以及精氨酸等白酒重要的風(fēng)味物質(zhì)或者風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[17-24]。5年窖齡窖泥中主要的細(xì)菌為阿姆莫利菌屬(Ampullimonas)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和曲桿菌屬(Curvibacter)，相對豐度分別為27.66%、13.94和5.98%。而在25年窖齡窖泥中，主要的優(yōu)勢細(xì)菌為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)(40.40%)、理研菌屬(Petrimonas)(12.70%)和產(chǎn)乙酸嗜蛋白菌屬(Proteiniphilum)(5.06%)。在70年窖齡窖泥中，優(yōu)勢細(xì)菌為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)(24.49%)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(2.78%)。

在5年窖齡中絕對的優(yōu)勢物種Ampullimonas、Lactobacillus，隨著窖齡的增加，相對豐度顯著減少，在25年窖泥中豐度僅有0.15%和1.17%，隨著窖齡進(jìn)一步增加，豐度略微有所提升，豐度為0.24%和2.77%。Ampullimonas為好氧菌，Ampullimonas豐度的降低，跟窖泥的厭氧環(huán)境有關(guān)。乳桿菌是窖泥中的重要微生物，代謝產(chǎn)生的乳酸濃香型白酒的香味物質(zhì)和香味物質(zhì)的前體物質(zhì)。并有研究認(rèn)為，在早期窖泥中，高豐度的Lactobacillus及其代謝產(chǎn)物可能在維護(hù)與保持窖泥低 pH 環(huán)境，抑制雜菌，馴化有益菌方面發(fā)揮重要作用[25]。值得注意的是，5年窖齡窖泥中豐度僅有2.53%的Caproiciproducens隨著窖齡的增加，豐度增加，在25年和70年窖齡中都是絕對的優(yōu)勢物種，在25年和70年窖齡窖泥中，相對豐度為40.40%和 24.49%。Caproiciproducens是一株代謝能夠產(chǎn)生氫氣、丁酸和己酸的一類細(xì)菌，在成熟窖泥中如此高的豐度，可能為濃香型白酒提供了最重要的香味物質(zhì)己酸乙酯提供前體物質(zhì)己酸[19]。一般和產(chǎn)甲烷古菌互營的Syntrophomonas隨著窖泥窖齡的增加，豐度也有明顯的增加，豐度從0.07%增加到了1.29%，隨著窖齡進(jìn)一步的增加，豐度又減少到了0.47%。Syntrophomonas能夠降解長鏈脂肪酸或丁酸產(chǎn)生氫氣、乙酸、丙酸[26]。

圖4 不同窖齡樣品細(xì)菌屬水平分布

2.4 古菌群落分布特征分析

2.4.1 不同窖齡窖泥古菌群落在門水平上的組成

在窖泥樣品中，古菌的微生物群落變化相對簡單。3個不同年代，15個窖泥樣品中古菌主要分布在3個門，8個綱，11個目，14個科和21個屬。這些古菌主要分布在廣古菌門(Euryarchaeota)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)和未分類的門內(nèi)。5年窖齡窖泥中的古菌多樣性相對比較豐富，除了分布在廣古菌門(Euryarchaeota)外，還分布在奇古菌門(Thaumarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)和一些未分類的門內(nèi)。25年窖齡窖泥中的古菌多樣性很單一，只分布在廣古菌門(Euryarchaeota)內(nèi)。而70年窖齡窖泥中的古菌分布在廣古菌門(Euryarchaeota)和泉古菌門(Crenarchaeota)。其中在3個年代的窖齡樣品中都占有最高豐度的廣古菌門(Euryarchaeota)在5年、25年和70年窖齡窖泥中分別占了96.50%，100%和99.81%(見圖5)。

圖5 不同窖齡樣品古菌門水平分布

2.4.2 不同窖齡窖泥古菌群落在屬水平上的組成

在屬的水平上，采用細(xì)菌多樣性的分析方法，得到了3個不同樣品的古菌的相對豐度圖，結(jié)果表明，古菌的優(yōu)勢物種主要有Candidatus_Methanoplasma,Methanobacterium,Methanobrevibacter,Methanosarcina,Methanoculleus,Methanocorpusculum,Methanosaeta和Methanocella。5年窖齡窖泥中優(yōu)勢古菌微生物為Methanobacterium,Methanobrevibacter,Methanosarcina和Methanoculleus，相對豐度分別為13.06%，26.39%，22.56%和9.36%。在25年窖齡窖泥中，優(yōu)勢古菌微生物為Candidatus_Methanoplasma,Methanobacterium和Methanoculleus，相對豐度分別為27.71%,30.15%和23.48%。而在70年窖齡窖泥中，優(yōu)勢古菌微生物主要為Candidatus_Methanoplasma,Methanobacterium和Methanobrevibacter，相對豐度分別為36.97%,25.94%和21.67%(見圖6)。

圖6 不同窖齡樣品細(xì)菌屬水平分布

隨著窖泥窖齡的增加，Candidatus_Methanoplasma不斷富集，在70年窖齡窖泥中，豐度高達(dá)36.97%，Candidatus_Methanoplasma豐度顯著提高，表明其可能在老窖泥中的重要地位。在5年窖齡窖泥中的優(yōu)勢物種Methanosarcina隨著窖齡的增加豐度逐漸降低，在25年和70年窖齡的窖泥中豐度僅有8.90%和3.25%。Methanocorpusculum和Methanocella隨著窖齡增加，豐度逐漸降低，到70年窖齡中，基本被淘汰。從代謝水平上看，窖泥中的主要優(yōu)勢產(chǎn)甲烷古菌都是多種營養(yǎng)類型的產(chǎn)甲烷古菌，主要利用氫氣和甲基類化合物，而只能以乙酸作為底物的Methanosaeta在所有窖齡窖泥中都不是優(yōu)勢古菌[27]，豐度極低。值得注意的是，窖泥中的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷古菌大多還能利用甲醇作為底物，窖泥中甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌還可能對濃香型白酒的質(zhì)量有著重要的關(guān)系。Candidatus_Methanoplasma和Methanosarcina在隨著窖齡的增加有明顯的正負(fù)相關(guān)性，或許可以作為新老窖泥判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

筆者發(fā)現(xiàn)窖泥中的Caproiciproducens是豐度最高的具有產(chǎn)己酸能力的細(xì)菌，H2是其的主要代謝副產(chǎn)物，并且窖泥中的氫營養(yǎng)型的Methanobacterium與Caproiciproducens在窖泥中隨年代的增加有同步變化的趨勢。這為前人提出的甲烷古菌常和產(chǎn)己酸菌互營，并通過種間“氫轉(zhuǎn)移”作用解除氫抑制，從而使反應(yīng)向有利于產(chǎn)生己酸的方向進(jìn)行的假說提供了有力的證據(jù)[28]。

3 結(jié)論

通過 16S r RNA 高通量測序解析四川成都某酒廠的3個不同年代的窖泥樣品的細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果表明：

(1)窖泥微生物主要分布28個細(xì)菌門和3個古菌門，厚壁菌門、變形桿菌門和放線菌門為優(yōu)勢的細(xì)菌門，古菌主要分布在廣古菌門。

(2)窖泥的優(yōu)勢微生物隨著窖齡的增加發(fā)生明顯的變化。隨著窖齡的增加，優(yōu)勢微生物從Ampullimonas和Lactobacillus變?yōu)榫哂挟a(chǎn)己酸能力的Caproiciproducens。

(3)窖泥中主要都是利用H2、甲酸、甲醇的產(chǎn)甲烷古菌，而利用乙酸的乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌不是窖泥中的優(yōu)勢物種。甲基營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷古菌可能對濃香型白酒的質(zhì)量有著非常重要的關(guān)系。Candidatus_Methanoplasma和Methanosarcina在隨著窖齡的增加有明顯的正負(fù)相關(guān)性，或許可以作為新老窖泥判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

(4)窖泥中的氫營養(yǎng)型的Methanobacterium與Caproiciproducens在窖泥中隨年代的增加有同步變化的趨勢。這為前人提出的甲烷古菌常和產(chǎn)己酸菌互營，并通過種間“氫轉(zhuǎn)移”作用解除氫抑制，從而使反應(yīng)向有利于產(chǎn)生己酸的方向進(jìn)行的假說提供了有力的證據(jù)。