高弘揚 許丹蕓 周良云

摘要 ? ?玻璃化是植物組織培養(yǎng)過程中特有的一種生理失調或生理病變，普遍發(fā)生于多種植物中。玻璃化試管苗呈透明或半透明的水浸狀，葉片卷曲畸形，分化及存活能力低，無法進行繼代培養(yǎng)及馴化移栽，給種苗商業(yè)化生產造成了嚴重的經濟損失，也限制了組織培養(yǎng)技術在種質資源保存及基因工程育種中的應用。目前，對玻璃化發(fā)生的機制尚沒有統(tǒng)一的認識。本文對玻璃化現象、發(fā)生機制以及預防措施等相關研究進行了綜述，以期為研究玻璃化發(fā)生發(fā)展的機制并開發(fā)有效的防控措施提供借鑒。

關鍵詞 ? ?植株組織培養(yǎng);試管苗;玻璃化;發(fā)生機制;防控措施

中圖分類號 ? ?S604 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）20-0052-05 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?Hyperhydricity（HH）is a physiological disorder and morphological malformation owing to stresses related to in vitro culture conditions，which often occurs in plant tissue culture. Hyperhydric plantlets show a typical glassy or vitrescent appearance，which is characterized by thick，translucent，curled，and brittle leaves. These plantlets survive very poorly when they are subcultured in fresh medium or transferred to an ex vitro environment. It can cause considerable losses in commercial micropropagation industry by reducing the quality and multiplication rate of the cultured plants. It also limits the application of tissue culture methods to the conservation of plant resources and genetic transformation of plants. Up to now，the molecular mechanism of HH is not yet clear.In this paper，research progress on the phenomena，mechanism and preventive measures of hyperhydricity were reviewed，in order to provide references for the study of the mechanism of hyperhydricity and the development of effective preventive and control measures.

Key words ? ?plant tissue culture;tube seedling;hyperhydricity;mechanism;control measure

組織培養(yǎng)技術可短時間內快速地生產大量無菌苗，當前已經被廣泛應用于植物脫毒、育種和快速繁殖。同時，組培技術還被認為是植物細胞生產具有高價值的次生代謝產物的良好途徑，在人參皂苷、紫杉醇等的生產中被寄予厚望。玻璃化現象是植物組織培養(yǎng)過程中時常發(fā)生的一種生理失調和生理病變的現象。發(fā)生玻璃化現象的植株，往往出現發(fā)育不良與分化能力低下等癥狀，玻璃化常導致試管苗生根困難，繼代成活率低，難以馴化移栽，嚴重的玻璃化還會導致植株死亡[1]。玻璃化現象最早在對石竹莖尖進行組織培養(yǎng)中被發(fā)現，Phillips和Mathews等人對這一現象進行了描述[2]，Debergh等[3]研究者首先提出了“玻璃化現象”一詞，并開始對其進行系統(tǒng)的研究。盡管有關玻璃化現象的研究已經開展了30余年，在玻璃化現象的預防和恢復上也有了相當的了解和應用，但玻璃化現象的分子機理仍然不甚明了，其具體誘因和發(fā)展途徑也眾說紛紜。玻璃化現象的出現具有普遍性，至今已經報道過上百種植物在組培過程中出現了玻璃化現象，草本植物的玻璃化現象多于木本植物。玻璃化現象與褐化現象、組培過程中的污染現象并稱植物組織培養(yǎng)的三大難題，每年都帶來巨大的經濟損失，是進一步發(fā)展現代農業(yè)的一大障礙。為了預防和恢復玻璃化，就必須對影響玻璃化發(fā)生的不同因素進行研究。

1 ? ?玻璃化試管苗的解剖結構及其生理生化變化

在形態(tài)學上，玻璃化的植物出現形態(tài)畸形，最直觀的表現為植株矮小，葉片及莖半透明化，葉片腫脹、失綠、脆弱易碎，葉片兩側向中間葉脈卷曲[4]。在植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)容器內相對濕度較高，內部環(huán)境和周圍環(huán)境之間的氣體交換不暢，乙烯過度積累，都可能是引起生理紊亂的原因。盡管對玻璃化發(fā)生的原因有很多假設，但仍然缺乏信號和代謝過程相關的研究來解釋玻璃化發(fā)生的機制。而且關于玻璃化與脅迫之間的關系也沒有完全建立，故很難確保玻璃化苗處于脅迫狀態(tài)。以前的研究認為，在形態(tài)學上觀察到的異常形態(tài)可能是由于細胞膜成分或DNA含量的改變引起的細胞水平上的變化。

1.1 ? ?形態(tài)學、解剖學和超微結構特征

玻璃化現象會導致植物在解剖結構和生理生化上發(fā)生變化。盡管不同植物的玻璃化表現不盡相同，但仍然具有一些較為普遍的表現。比如玻璃化苗的葉片腫脹、半透明、皺褶、卷曲和易碎。玻璃化苗的干重百分率較低，表明玻璃化葉片與正常葉片相比，葉綠素含量降低并含有更多的水分。玻璃化苗最顯著的特征就是植物組織中過度積水，這可能導致組織中氣體流通不暢，從而耗盡細胞中的氧氣。玻璃化苗葉片的解剖結構也發(fā)生了變化，例如柵欄組織缺少或缺失，氣孔不規(guī)則，葉綠體退化，葉肉細胞間隙擴大，淀粉粒與質粒積累，葉表缺少角質層蠟質，維管組織退化，細胞液泡化甚至破碎等。根系發(fā)育不良，莖頂端分生組織較小[5-6]。表皮組織發(fā)育不良，角質層、蠟質發(fā)育不完全或缺失，氣孔減少、畸形，疏導組織發(fā)育不良，維管束系統(tǒng)發(fā)育不良或缺失[7-8]。葛紅娟等[9]對于蘋果莖葉的研究發(fā)現，玻璃化試管苗葉片表皮細胞空洞腫脹，間隙大，柵欄組織較少，海綿組織結構松散且高度液泡化，而正常苗葉片的表皮細胞排列緊密，柵欄組織比玻璃化植株要厚，海綿細胞完整且分布均勻。

Sreedhar等[10]對香草的研究表明，玻璃化的發(fā)生會導致維管組織和皮層組織的退化和氣孔開閉異常。Picoli等[11]對桉樹的研究發(fā)現，玻璃化葉片的細胞壁變薄，細胞器減少，間隙變大，并且明顯液泡化。在玻璃化蘋果葉片中，表皮層形狀不規(guī)則并且結構被破壞。正常葉片氣孔有腎形保衛(wèi)細胞，氣孔邊緣的細胞壁增厚，發(fā)育良好，形成突起橢圓形孔脊。但是玻璃化苗氣孔則表現出異常結構，表現為不規(guī)則保衛(wèi)細胞[4]。解剖學研究表明，玻璃化葉片只有疏松的葉肉組織。對蘋果玻璃化苗葉肉細胞進行超微結構觀察發(fā)現，其細胞質極為稀疏和雜亂。玻璃化苗的葉綠體數量很少并且含有較大的淀粉粒，有時一個淀粉粒占據整個質體。大多數葉綠體的基質增多，液囊基粒間經常受到異常壓縮和擴張，從而使葉綠體的整個結構退化。在嚴重的玻璃化葉片中，細胞中葉綠體和其他亞細胞器基本上都發(fā)生退化。Olmos和Hellin[7]對香石竹的玻璃化苗進行觀察，得到了相似的結論。在胡椒的玻璃化苗中，葉綠體表現出類囊體紊亂、葉綠體基粒含量降低、大量淀粉顆粒的積累。雖然線粒體和過氧化物酶體的結構在玻璃化植物中沒有改變，但過氧化物酶體的數量卻顯著增加。

同樣，在玻璃化植物器官中也觀察到了一些解剖學特征，如皮質和髓薄壁組織增大，細胞間隙增大，維管系統(tǒng)木質化減少[4]。Picoli等[11]發(fā)現玻璃化植物中維管系統(tǒng)減少。然而，目前還不清楚玻璃化苗中維管系統(tǒng)的功能是否也受到影響。在櫻桃和牛至的研究中發(fā)現，木質素酶活性的降低使木質素含量減少[12]。Saher等[5]報道了3個品種的香石竹玻璃化苗葉片中總果膠含量均顯著低于正常苗。

1.2 ? ?生理生化變化

玻璃化苗在生理生化性質上也具有顯著的特點。玻璃化植株常見的生理生化異常有水勢顯著升高、自由含水量增高、組織含水量高于正常植株、干鮮重比明顯降低。組織水含量上升是玻璃化現象的最典型生理特征，也是玻璃化植株葉片呈透明或半透明的直接原因，通常認為與培養(yǎng)基的滲透壓、培養(yǎng)瓶空氣的相對濕度和葉片氣孔的關閉有關[13]，這種異常的水含量可能會影響植物體形態(tài)發(fā)育和對營養(yǎng)物質的吸收和運輸，從而使植株發(fā)育不良[14]。

玻璃化苗葉片中葉綠素（包括葉綠素a和葉綠素b）和類胡蘿卜素含量顯著降低，這可能是由于玻璃化苗葉片中葉綠體數量減少所致[4]。葉綠素主要分布在葉綠體類囊體膜上，是光合作用的主要色素，負責在光反應階段將光能轉化為電能。另外，植物呈現綠色的原因是由于植物細胞中有大量葉綠素存在。而葉綠素含量的下降會使植物對光的利用能力下降，發(fā)生失綠現象。葉綠素含量下降的原因一般認為是合成系統(tǒng)受損或受阻[14]，同時又持續(xù)分解導致的。在甜櫻桃中發(fā)現玻璃化苗光合作用能力下降[15]。葉綠素含量的降低導致了光合作用的減弱，進而導致了玻璃化苗合成糖類和蛋白能力下降，干/濕重比下降。糖、蛋白質等干物質含量的下降通常認為是光合作用、蛋白質合成等代謝過程受阻以及水分的過度積累導致的，干物質的減少可能直接導致了玻璃化苗的營養(yǎng)缺失，生長緩慢，增殖率低[14]。玻璃化苗體內還原糖、蔗糖以及K+、Ca2+、Cl-的含量明顯增高，木質素與蛋白質、粗纖維、肌醇、Fe2+、Cu2+的含量則明顯降低[16]。含量減低的原因一般認為與其他干物質類似，是合成受阻所致，含量升高則可能是由于淀粉合成受阻或糖利用率下降使可溶性糖積累[17]。豌豆發(fā)生玻璃化與其DNA含量異常有關，DNA含量的降低阻礙了植物根莖的再生。細胞壁的性質和組成的改變可以被認為是玻璃化苗形態(tài)異常的最重要因素之一。木質素含量低、木質素生物合成減慢、維管系統(tǒng)木質化減少被認為是玻璃化發(fā)生的可能原因之一[18]。玻璃化苗中細胞壁主要成分纖維素和木質素都發(fā)生改變[19-20]。這可能導致細胞膨壓降低、水勢變化，從而使攝取的水分增加并造成組織的高度含水。玻璃化香石竹葉片POD活性高、MDA含量高、木質素含量低，表明玻璃化苗組織處于氧化脅迫狀態(tài)。對玻璃化苗的多胺含量進行了研究，在玻璃化苗和正常苗中多胺的最主要成分部分是游離聚亞胺，發(fā)現玻璃化發(fā)生后多胺含量發(fā)生明顯改變[21-22]。玻璃化苗的恢復也與多胺有關。

體外培養(yǎng)的植物會遭受各種脅迫，包括外植體損傷、培養(yǎng)基的高滲透性（高蔗糖和銨含量）、相對濕度較高和生長調節(jié)劑的濃度不適當[23]。截至目前，猜測可能有2種類型的玻璃化，一種是由水被動擴散到組織中，另一種是與代謝過程中系統(tǒng)紊亂有關。玻璃化苗組織在質外體中積聚水分并在細胞周圍形成水層。植物組織中過量的水分積聚是玻璃化癥狀最顯著的特征，會導致組織內通氣不暢，從而降低氧氣含量并限制其在細胞中的擴散[13]。缺氧可以導致過量的H2O2積累[24]。因此，有人提出玻璃化苗組織可能處于低氧脅迫狀態(tài)[20，25]。這種低氧脅迫能顯著影響芽的代謝和能量的利用，從而影響細胞的呼吸過程。在低氧脅迫條件下，植物組織中脂質過氧化物的增加引起了氧化損傷[26]。通過丙二醛（MDA）的積累來確定脂膜過氧化程度，是公認的檢測膜氧化損傷程度的指標。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化作用的終產物，可在一定程度上反映自由基的積累程度，其含量的顯著上升也反映了玻璃化植株中超氧自由基的積累，可以看出玻璃化植株確實面臨著嚴重的低氧脅迫。Le Dily等[27]研究表明，甜菜玻璃化苗因為受到氧化脅迫導致其脂質過氧化。脅迫條件導致活性氧水平的升高，并通過氧化活性化合物引起氧化還原平衡的變化，導致脂質過氧化和降解。脂質過氧化可能有2個來源，即脂氧合酶（LOX）氧化或活性氧[28]。LOX的活性與脂質過氧化有關，櫻桃玻璃化苗LOX活性比正常苗的LOX活性明顯增強。Bachmann等[29]研究表明，LOX在葉綠體中被激活，在葉綠體膜的破壞和葉綠體降解過程中起著一定的作用。一些來源于LOX通路的產物在信號轉導通路中具有信使功能，或者作為過氧化物對細胞分化造成有害影響[30]。盡管已知各種植物細胞可產生H2O2，但是缺氧過程中脂質過氧化的機制尚不清楚。

植物抵抗活性氧毒性作用時主要取決于還原分子和抗氧化酶的活性。最近的研究表明，氧化脅迫（包括超氧化物、羥基自由基和過氧化氫）是玻璃化苗發(fā)生的重要因素[31]。ROS的最重要來源是葉綠體、線粒體、過氧化物酶體和細胞質[32]。玻璃化苗苯丙氨酸裂解酶（PAL）含量下降，苯丙氨酸裂解酶（PAL）是控制木質素合成的關鍵酶，其含量的下降意味著玻璃化植株中木質素合成受阻[33]。木質素廣泛存在于植物體中，包圍于管胞、導管及木纖維等纖維束細胞及厚壁細胞外，與纖維素、半纖維素一起形成植物骨架的主要成分。木質素填充于纖維素構架中增強植物體的機械強度，利于輸導組織的水分運輸和抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。超氧化物歧化酶（SOD）是一種強力的抗氧化酶，能夠催化生物體內超氧化物自由基的歧化反應，能夠清除自由基，具有抗氧毒性、抗輻射損傷、抗衰老等作用[34]。SOD在玻璃化苗中的活性變化在已有研究中結果并不一致，Shady Saher等[35]人對康乃馨的研究表明，玻璃化苗中SOD活性上升;Sreedhar等[10]對香草的研究表明，SOD活性在玻璃化的過程中下降;趙 ?劍等[36]對梨芽快速繁殖的玻璃化現象研究中發(fā)現，正常試管苗和玻璃化苗在培養(yǎng)過程中SOD 活性均迅速上升，正常苗的酶活性略高于玻璃化苗，但差異不顯著。過氧化物酶（POD）以過氧化氫為電子受體催化酚類和胺類化合物氧化，能同時消除過氧化氫和酚類、胺類毒性，在植物的抗逆性生理反應中有重要作用。POD在玻璃化過程中總體上呈上升趨勢，而對于其同工酶有堿性過氧化物酶活性上升，酸性過氧化物酶活性下降的理論[37]。堿性過氧化物酶有IAA 氧化酶的功能，可以反映內源生長素水平，故其活性的增高可能反映了內源生長素水平的降低[38]。過氧化氫酶（CAT）催化過氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細胞的過氧化物體中，其活性在玻璃化過程中存在一個先上升后下降的過程。

內源激素的變化情況同樣較為復雜。吳 ?迪等[39]對雜種山楊的研究表明，雜種山楊玻璃化苗的赤霉素GA含量顯著下降，而IAA含量則較高。Kevers和Gaspar[40]的研究報道，發(fā)生玻璃化的石竹組織乙烯生成速度加快，乙烯含量高于正常組織。玻璃化植物體內大量物質的活性或含量變化表明，玻璃化現象是植物體內的一種復雜生理現象，涉及多條代謝、調控途徑，要對這一現象進行研究，必須對影響玻璃化現象的每種因素進行逐一研究。

2 ? ?影響玻璃化發(fā)生的因素

各種研究發(fā)現，影響玻璃化發(fā)生的因素多種多樣，但當前一般認為，玻璃化的發(fā)生主要與組培材料、培養(yǎng)室光照、溫度、通風、培養(yǎng)基有關。同時，玻璃化的發(fā)生往往不是單一因素的結果，而是由多種因素共同作用引起。

2.1 ? ?組培材料的選擇

玻璃化的發(fā)生除了與植物的種類有關之外，與組培材料的取材部位及所取材料大小也有關系[41]。一些植物如石竹、蘆薈等更容易發(fā)生玻璃化現象。頂芽等新分化的組織相比于已經木質化的組織而言更容易發(fā)生玻璃化，分化程度較低的組織比分化程度較高的組織更容易發(fā)生玻璃化。較小的外植體由于所處環(huán)境更接近培養(yǎng)基表面，濕度更大，因而更容易出現玻璃化。選用愈傷組織時，最好選擇繼代次數在3次以內的愈傷組織，剪取材料大小一般以0.5 cm左右為宜，這樣既能實現較高的出芽率，也能降低玻璃化的發(fā)生率。

2.2 ? ?光照條件

一般認為，接近自然光的光照條件可以降低玻璃化的發(fā)生率，并且通過自然光照可以恢復一些玻璃化苗。陳兵先等[42]認為可通過將玻璃化苗置于陽光下而實現玻璃化的復原，并認為這是由于紫外線促進了試管苗的成熟和木質化。對不同品種外植體而言，光照時間、光照強度、光照波長范圍對于玻璃化的影響不盡相同，這表明光照對外植體玻璃化的影響程度可能與外植體品種有關。

2.3 ? ?溫度

通過降低培養(yǎng)溫度，可以間接地降低培養(yǎng)器皿內的相對濕度，同時也可以減緩細胞新陳代謝和分裂速度，增加細胞分裂前的干物質積累量，被認為有助于防止玻璃化的發(fā)生。一般而言，植物組織培養(yǎng)的溫度控制在24～26 ℃之間最為適宜，通過適當的低溫處理或加大晝夜溫差，也可以有效預防和恢復玻璃化現象[43]。降低溫度或提高溫差能夠促進干物質的積累，從而抑制或使玻璃化得到恢復。但是降低培養(yǎng)溫度也將導致組培增殖系數降低，因而低溫處理防止玻璃化的方法有其局限性。

2.4 ? ?通風與氣體交換

一般認為，加強培養(yǎng)環(huán)境的通風條件，改善封口材料的透氣性能有助于降低培養(yǎng)環(huán)境中空氣的相對濕度，降低環(huán)境水勢，從而降低環(huán)境整體的水分壓力，減少玻璃化現象的發(fā)生[44]。有研究表明，在香石竹的組織培養(yǎng)過程中，采用8層紗布封口的苗，玻璃化苗發(fā)生少，且試管苗形態(tài)接近正常苗，而采用牛皮紙封口的試管苗則更容易大量吸水，組織膨脹，莖葉變?yōu)榘胪该鳡睿尸F玻璃化特征。同時，良好的氣體交換也有助于乙烯的擴散，降低培養(yǎng)器皿內的乙烯濃度，從而減少玻璃化的發(fā)生率。

2.5 ? ?培養(yǎng)基

一般認為，液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基相較于固體培養(yǎng)基更容易導致玻璃化現象。因此，增加培養(yǎng)基中的瓊脂濃度被認為是有效預防玻璃化的方法，但瓊脂濃度過高不利于養(yǎng)分的傳輸和植物的生長，因而最佳瓊脂濃度要根據組培植物而定。結冷膠是一種新型的微生物多糖膠凝劑，具有耐熱耐酸性好、透明度高、強度高等優(yōu)點，同時，結冷膠凝膠能力較強，通常用量較瓊脂可以減少一半以上。結冷膠被認為相對于瓊脂更容易導致植物組織發(fā)生玻璃化，在結冷膠上進行組培可以誘導玻璃化的發(fā)生[13]。

MS培養(yǎng)基被認為是較不容易產生玻璃化苗的培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)基中NH4+過多會傷害木質素合成相關的酶，適當降低培養(yǎng)基中的NH4+或以NO3-代替NH4+有助于預防玻璃化苗的產生。降低培養(yǎng)基中細胞分裂素的濃度有助于降低玻璃化發(fā)生率[44]。增加培養(yǎng)基配方中的蔗糖也被認為能減少玻璃化的發(fā)生，但增加蔗糖會使生產成本升高，并提高污染的可能性，建議將蔗糖濃度保持在3%～4%之間。同時，有報道稱，將培養(yǎng)基中的蔗糖換為果糖能減少玻璃化苗的產生，但也有人發(fā)現用葡萄糖替換蔗糖后玻璃化發(fā)生率反而上升[45]。因此，關于選用不同碳源是否能減少玻璃化發(fā)生率尚無統(tǒng)一的結論。最后，有報道指出，在MS培養(yǎng)基中適量加入活性炭或鈣離子都能抑制和恢復玻璃化。

3 ? ?玻璃化發(fā)生機制

玻璃化現象在自然條件下并不會發(fā)生，僅發(fā)生在組織培養(yǎng)中，且引發(fā)原因多種多樣，通常認為玻璃化的發(fā)生是人工提供的相似的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，不能完全符合不同種類培養(yǎng)物固有需求，而引起的適應性問題。當前，玻璃化現象發(fā)生的原因眾說紛紜，沒有統(tǒng)一的結論。一些研究認為，玻璃化現象發(fā)生的原因在于外部器官形態(tài)結構異常導致失水率下降，水分過度積累，進而引發(fā)內部生理失調。另一些研究則認為，玻璃化現象發(fā)生的原因在于內部生理失調，而外部結構畸變則僅是其外在表現，不是玻璃化現象的原因[46]。黃宇翔等[47]以5個品種的香石竹為材料，發(fā)現降低細胞分裂素濃度、增加光照強度、增加蔗糖濃度、提高瓊脂濃度都可能降低玻璃化發(fā)生率，但不同品種間有差異;Mariyana Ivanova等[48]研究了女王蘆薈的玻璃化現象與NH4+、細胞分裂素之間的關系，發(fā)現只有在高濃度的NH4+條件下，細胞分裂素濃度的增加才會明顯引起玻璃化發(fā)生率的增加，并由此得出細胞分裂素只有在其他條件不適宜的情況下才會促進玻璃化發(fā)生的結論;Yadav等[49]在研究康乃馨的最佳培養(yǎng)條件時也發(fā)現調整鐵離子和鎂離子的濃度可以有效抑制增加細胞分裂素濃度所引起的玻璃化，甚至可以將發(fā)生率降至零。可見細胞分裂素并不是玻璃化的誘發(fā)因素，只是促進因素。另外，有玻璃化的實質是細胞分裂與體積增大的速度超過了干物質的產生與積累的速度的觀點。據此可以認為培養(yǎng)條件不適宜導致的細胞生長分裂速率與物質合成速率不協(xié)調是玻璃化產生的原因。此外，對于引起玻璃化的原因還有培養(yǎng)基的滲透壓過低或培養(yǎng)瓶中相對濕度過高，使水的可用性增加而引起植株吸水過多的觀點。已經有研究指出，組培環(huán)境下高濃度的細胞分裂素抑制酸性過氧化物酶與苯丙氨酸酶的活性，阻礙木質素與纖維素的形成，促進了植物細胞的吸水[23]，通氣狀況不良抑制了磷酸戊糖與光呼吸途徑，使葉綠素、蛋白質、細胞壁、核酸的合成受阻，使乙醇酸與乙烯過度積累。因此，許多研究者認為玻璃化的原因應當歸結于人工組培環(huán)境與自然環(huán)境差異形成的脅迫，如高鹽濃度、高相對濕度、低光強、容器內氣體積累等引起的氧化應激。組培環(huán)境下，逆境脅迫使相關的酶活性與代謝途徑受到影響乃至改變，毒害物質與氧化物質不斷積累，進而導致植物器官（氣孔、維管、根等）發(fā)育畸形，功能受損，最終誘發(fā)玻璃化現象。而Tian等[50]表明質外體的過量活性氧的積累是玻璃化發(fā)生的主要原因。

以上觀點都可以對玻璃化現象做出一定程度的解釋，但都無法解釋正常植株與玻璃化植株存在于同一個培養(yǎng)瓶中的現象。對此，有關于增加甜菜特定染色體導致玻璃化發(fā)生率增加[51]的報道，這說明玻璃化發(fā)生的難易程度可能與某些基因有關，這意味著同一物種不同個體間的玻璃化概率存在個體差異。

綜上，關于玻璃化的發(fā)生原因至今仍沒有統(tǒng)一的結論。

4 ? ?玻璃化的預防與恢復

針對試管苗玻璃化現象發(fā)生的影響因素，可以采取一些措施對其進行控制和克服。當前對于玻璃化的應對措施主要是預防和恢復。玻璃化的預防是通過各種處理減少玻璃化的發(fā)生概率，而玻璃化的恢復則是經處理使玻璃化苗恢復正常的生理功能，最終成長為正常植株。由于不同物種甚至品種間情況有差異，尚未有完全可以通用的方法，但一些植物已有較成熟的技術?，F有的控制與恢復方法都是通過分析玻璃化試管苗的生理變化來調整培養(yǎng)條件，進而達到目的，通常從以下幾個方面入手。

（1）調節(jié)水勢。增加瓊脂濃度，抑制植物對水的吸收;使用透氣較好的封口材料，降低培養(yǎng)瓶中空氣的相對濕度;增加蔗糖或其他粒子濃度，以增加培養(yǎng)基滲透壓，降低水勢，抑制水吸收[51]。

（2）調整培養(yǎng)基中的離子含量。調整鈣離子含量，鈣離子參與細胞壁的構成，影響光合作用，能促進代謝。調整NH4+濃度，NH4+會促進玻璃化的發(fā)生，以NO3-代替NH4+作為氮源可以抑制玻璃化的發(fā)生[52];Bornman等[53]在挪威云杉離體培養(yǎng)中發(fā)現，使用脫乙酰吉蘭糖膠，玻璃化頻率高達67%，而使用瓊脂，玻璃化頻率僅為18%。

（3）調節(jié)激素含量。一般認為細胞分裂素會促進玻璃化的發(fā)生，而生產中為了加快繁殖速度會向培養(yǎng)基中加入適當的激素以促進生長，因而選擇適當的種類和濃度非常重要[54]。戴麗娜等的研究表明KT對玻璃化的促進作用小于6-BA，2種細胞分裂素濃度提高均會影響恢復效果[55]。

（4）調節(jié)培養(yǎng)條件。適當降低溫度有利于玻璃化試管苗的恢復[5]，在玻璃化試管苗的恢復時發(fā)現，在一定溫度范圍內，蘆筍玻璃化試管苗的恢復率隨培養(yǎng)溫度的降低而升高;適當增加光強有利于玻璃化苗的恢復，蘆筍玻璃化試管苗的恢復率隨光照強度明顯升高，當光照強度為5 200 lx時，恢復率可達到70.55%。增加通風條件，也可以降低玻璃化發(fā)生率[44]。Muneer等[56]研究表明，紅色和藍光LED通過維持類囊體蛋白的組成和抗氧化防御機制從而控制玻璃化的發(fā)生。

（5）適當添加玻璃化抑制劑。Klerk等[57]表明三氯乙酸乙酯（TCA）可以通過增加的表皮蒸騰作用，從而抑制玻璃化的發(fā)生。也有相關研究表明外源添加Si離子可以增強植物體內抗氧化酶活性，從而降低體內活性氧的積累抑制或者恢復玻璃化。而外源添加一些活性氧抑制劑，如水楊酸和抗壞血酸，也可以抑制玻璃化[58]。外源添加多胺可以增加抗氧化酶活性和總酚含量，從而降低玻璃化率[22]。添加乙烯抑制劑如銀離子、氯化鈷、氨氧乙酸等，可以通過降低組織內乙烯的積累也可以抑制玻璃化發(fā)生。Mayor等[59]研究表明添加硝酸銀和氯化鈷可以抑制玻璃化。Vinoth等[60]也得到了一致的結果，添加銀離子可以降低玻璃化的發(fā)生。也有研究表明添加一些稀有金屬也可以抑制玻璃化。添加活性炭、聚乙烯醇也可以降低玻璃化發(fā)生率。其他玻璃化抑制劑還有如聚乙烯醇等滲透作用調節(jié)劑。一般而言，在實際生產中，玻璃化的預防比玻璃化的恢復更為普遍，也更為有效。

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