劉春都,朱葉飛

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,南京 210011；2.南京市浦口醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京 210031)

銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染最常見的條件致病菌之一[1],特別是近年來隨著廣譜抗菌藥物過度應(yīng)用，以及各種侵襲性、損傷性診斷、治療手段的使用，銅綠假單胞菌的耐藥率不斷升高[2]，對臨床常用的抗菌藥物敏感性逐漸降低，出現(xiàn)了對3種或以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的銅綠假單胞菌菌株，即多重耐藥銅綠假單胞菌(multiple drug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDR-PA)。據(jù)專家共識(shí)[3]，一些常規(guī)、單一的抗菌藥物對MDR-PA幾乎沒有效果，臨床上往往需要采用聯(lián)合用藥的方式對MDR-PA進(jìn)行有效治療，這就需要選擇有效的藥物聯(lián)合方式。中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)感染學(xué)組于2014年發(fā)布的銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識(shí)[3]指出：對感染嚴(yán)重的患者必須采用聯(lián)合用藥的方案，充分發(fā)揮聯(lián)合藥物之間的協(xié)同和相加效應(yīng)來增強(qiáng)抗菌效應(yīng)，以便對MDR-PA進(jìn)行有效治療。本研究通過體外藥物敏感試驗(yàn)來選擇對MDR-PA敏感的聯(lián)合藥物，以對臨床MDR-PA感染進(jìn)行有效的治療。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2015年1月至2017年12月南京市浦口醫(yī)院細(xì)菌室分離保存的全部32株MDR-PA，所有菌株均按醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程的要求分離、培養(yǎng)，并經(jīng)VITEK-60微生物儀鑒定，紙片擴(kuò)散法(K-B法)確認(rèn)，篩選出MDR-PA。其中男18例、女14例，年齡48～89歲，標(biāo)本來自南京市浦口醫(yī)院住院患者的痰液、血液和尿液等，同一患者相同部位分離的菌株不重復(fù)計(jì)算。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購自國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.2儀器、試劑和藥物 VITEK-60微生物鑒定儀及其配套的鑒定卡和藥敏卡，以及麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁儀購自法國生物梅里埃公司，接種儀、96孔平板、M-H瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板購自浙江拱東醫(yī)療科技有限公司，凈化工作臺(tái)、電熱恒溫孵育箱和細(xì)胞培養(yǎng)箱購自安徽中科都菱商用電器公司，所有藥敏紙片和藥敏試劑購自法國生物梅里埃公司。

1.3菌株復(fù)溶、培養(yǎng)、鑒定、配制菌液，篩選出MDR菌株 將超低溫冰箱保存的菌株復(fù)溶、培養(yǎng)、鑒定并挑取已經(jīng)分離純化的2～3個(gè)菌落于0.9% NaCl注射液中，將菌液稀釋成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)單位備用，并采用K-B法篩選出MDR-PA,即對不少于3種常規(guī)抗菌藥物耐藥的菌株為MDR[3]。

1.4聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識(shí)[4-5]，選擇替卡西林/克拉維酸+氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦+環(huán)丙沙星、美羅培蘭+環(huán)丙沙星、依替米星+哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶+阿米卡星、多黏菌素E+環(huán)丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦+左氧氟沙星、頭孢吡肟+環(huán)丙沙星共8組藥物聯(lián)合，采用微量棋盤稀釋法，以各單藥MIC的2倍為最高濃度，依次倍比稀釋8個(gè)稀釋濃度，取配伍的兩種稀釋藥物各50 μL加入平板孔中，再加入100 μL稀釋后的菌液于各孔中，使菌液濃度為5×105CFU/mL。以銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株，單用的每種抗菌藥物做3個(gè)復(fù)孔，聯(lián)用的每組藥物也做3個(gè)復(fù)孔，分別測定MIC值，以每種(或每組)藥物所得的3個(gè)MIC值的中間值為該種抗菌藥物的最終MIC值。

1.5部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)計(jì)算和判讀標(biāo)準(zhǔn) FIC指數(shù)=甲藥聯(lián)用/甲藥單用+乙藥聯(lián)用/乙藥單用，依據(jù)指數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)FIC指數(shù)≤0.5、0.52.0，分別表示為協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗[6-8]。

2 結(jié) 果

2.1MDR-PA的年份變化 收集南京市浦口醫(yī)院細(xì)菌室2015—2017年分離培養(yǎng)和鑒定的32株MDR-PA，其中2015年9株、2016年11株、2017年12株。

2.2MDR-PA樣本來源 32株MDR-PA中，痰液14株，占43.8%；尿液6株，占18.8%；血液5株，占15.6%；膿液4株，占12.5%；其他樣本3株，占9.4%，見表1。

表1 2015—2017年32株MDR-PA樣本來源 (株)

MDR-PA:多重耐藥銅綠假單胞菌

2.3MDR-PA科室分布 32株MDR-PA自于ICU 10株，占31.3%；其次分別是腫瘤科7株,占21.9%、呼吸內(nèi)科5株,占15.6%，老年科6株,占18.8%，其他科室4株,占12.5%。見表2。

表2 2015—2017年32株MDR-PA科室分布 (株數(shù))

MDR-PA:多重耐藥銅綠假單胞菌

2.4MIC值及其比較 在本試驗(yàn)的8組配對藥物中，只有頭孢吡肟與環(huán)丙沙星聯(lián)用的MIC值在聯(lián)用前后相同，頭孢吡肟在單用時(shí)MIC值為16 μg/mL，與環(huán)丙沙星聯(lián)用后，MIC值仍為16 μg/mL，沒有變化；在這組藥物中，另一種藥物環(huán)丙沙星也是單用與聯(lián)用時(shí)MIC值均為8 μg/mL，也沒有變化。其余7組聯(lián)用藥物中，各組每種藥聯(lián)合與單獨(dú)使用時(shí)MIC值均下降明顯。如替卡西林/克拉維酸與氨曲南的MIC值均從單用的64 μg/mL下降到16 μg/mL，其余每組的情況見表3。

表3 8組配對藥物聯(lián)合與單獨(dú)時(shí)對MDR-PA的MIC值 (μg/mL)

MDR-PA:多重耐藥銅綠假單胞菌；*每組聯(lián)合藥物聯(lián)用時(shí)，采用棋盤稀釋法得這兩種藥物最佳抑菌濃度比作為聯(lián)合使用時(shí)各自的MIC

2.58組聯(lián)合藥物對32株MDR-PA的藥物效應(yīng)構(gòu)成比 在這8組藥物中，只有頭孢吡肟與環(huán)丙沙星聯(lián)用這組，藥物效應(yīng)表現(xiàn)為無關(guān)時(shí)的構(gòu)成比占71.9%，即這組藥物聯(lián)用時(shí)對試驗(yàn)的32株MDR-PA有23株表現(xiàn)為拮抗作用。其余7組聯(lián)用藥物，藥物效應(yīng)表現(xiàn)是協(xié)同與相加效應(yīng)的占85%以上。8組聯(lián)合藥物對32株MDR-PA的藥物效應(yīng)構(gòu)成見表4。

表4 8組聯(lián)用藥物藥學(xué)效應(yīng)的構(gòu)成比 [株(%)]

TCC：替卡西林/克拉維酸；ATM:氨曲南；TZP:哌拉西林/他唑巴坦；CIP:環(huán)丙沙星；MEM:美羅培南；ETM:依替米星；AKN:頭孢他啶；CAZ:阿米卡星；COL：多黏菌素E；SCF頭孢哌酮/舒巴坦；LVX:左氧氟沙星；FEP:頭孢吡肟

3 討 論

銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染最常見的革蘭陰性菌，隨著抗菌藥物的濫用，銅綠假單胞菌的耐藥率不斷升高，并出現(xiàn)MDR-PA[9]。2015—2017年南京市浦口醫(yī)院共分離出32株MDR-PA，2015—2017年分別是9株、11株和12株，呈逐年上升趨勢。

南京市浦口醫(yī)院分離的MDR-PA主要來自呼吸道樣本，與2017年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示的結(jié)果一致[10]。本研究約85%的MDR-PA來自呼吸道分泌物、尿液、血液、傷口膿液等標(biāo)本；主要分布在ICU、腫瘤科和老年科等臨床科室，主要原因是這些科室患者免疫力差，機(jī)械性或侵入性診療多，細(xì)菌感染的機(jī)會(huì)多。MDR-PA主要通過鈍化酶或滅活酶、β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物作用靶位-青霉素結(jié)合靶位的改變、生物膜的形成、外膜孔道蛋白通透性降低、從外界獲得耐藥基因、外排系統(tǒng)的過度表達(dá)等方式獲得耐藥性[11-12]。每株MDR-PA的耐藥性往往是幾種耐藥機(jī)制綜合作用的結(jié)果，因此要找到對這株MDR-PA有效的藥物，一是研制針對這種細(xì)菌新的藥物；二是通過藥敏試驗(yàn)找到敏感的藥物抑制或殺滅MDR-PA，從而達(dá)到治療的目的[13]。

MDR-PA對單一抗菌藥物療效差，多主張聯(lián)合用藥[14]。但聯(lián)合用藥不是任意兩種抗菌藥物的運(yùn)用，不合理的運(yùn)用可減少抗菌藥的抗菌活性，甚至發(fā)生中毒、二重感染等嚴(yán)重后果[15]，所以必須符合聯(lián)合用藥指征：在嚴(yán)重感染而又必須立即進(jìn)行抗菌治療時(shí)可聯(lián)合用藥，以擴(kuò)大抗菌范圍；對單一用藥無效的嚴(yán)重感染；長期單一用藥易發(fā)生耐藥時(shí)；聯(lián)合用藥可降低單一用藥劑量，從而減少不良反應(yīng)時(shí)，可考慮聯(lián)合用藥[16-17]。

本研究8組聯(lián)合藥物中，除多黏菌素E與環(huán)丙沙星以及替卡西林/克拉維酸與氨曲南外，其余6組均是β-內(nèi)酰胺抗菌藥物與氨基糖苷類或氟喹諾酮類聯(lián)合運(yùn)用。依據(jù)專家共識(shí)，對MDR-PA采用了8組藥物聯(lián)合，其中替卡西林/克拉維酸、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦在與各自配對藥物使用前后的MIC值聯(lián)用是單用的1/4；環(huán)丙沙星、依替米星、頭孢他啶、多黏菌素E、左氧氟沙星的MIC值聯(lián)用是單用的1/2；但頭孢吡肟與環(huán)丙沙星聯(lián)用時(shí)，MIC值在聯(lián)用前后保持不變。在選用的8組配對藥物中，未出現(xiàn)MIC值增加的情況(即配對組合的兩種藥物聯(lián)用后，抗菌效應(yīng)降低)，絕大多數(shù)(8組配對藥物中，有7組)配對藥物組合的MIC值有明顯降低，說明對MDR-PA的感染，聯(lián)合用藥能夠取得比單一用藥更好的效果[15]。從作用機(jī)制上分析，β-內(nèi)酰胺類抗生素主要是作用于細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合靶位，造成細(xì)胞壁的破壞而發(fā)揮殺菌作用。氨基糖苷類雖然具有耳、腎毒性作用限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，但聯(lián)合用藥時(shí)用量減少，從而降低毒性作用，因此在臨床上可以推廣應(yīng)用。據(jù)2016年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)可知，多黏菌素和阿米卡星是常用的對銅綠假單胞菌耐藥率最低的兩種抗菌藥物，耐藥率分別為0.9%、6.1%，而氨曲南的耐藥率達(dá)到了31.4%，當(dāng)與替卡西林/克拉維酸配對聯(lián)合運(yùn)用后，MIC值從64 μg/mL下降到16 μg/mL[16]。這是因?yàn)樘婵ㄎ髁?克拉維酸與氨曲南配對運(yùn)用后既對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定又對金屬酶穩(wěn)定，因此不易被分解而發(fā)揮抗菌作用[18-19]。多黏菌素E由于具有肝、腎以及神經(jīng)毒性作用，臨床應(yīng)用受限，但當(dāng)多黏菌素E與環(huán)丙沙星聯(lián)合用藥時(shí)可以減少用量，使毒性作用降低，這就滿足了在臨床上應(yīng)用的要求[20]。頭孢吡肟與環(huán)丙沙星聯(lián)合運(yùn)用后MIC值無變化，而單獨(dú)使用時(shí)均具有較強(qiáng)的抗銅綠假單胞菌活性，耐藥率低(頭孢吡肟耐藥率為18.7%、環(huán)丙沙星為6.1%)，原因可能是頭孢吡肟與環(huán)丙沙星聯(lián)合使用時(shí)，與MDR-PA相應(yīng)靶位的結(jié)合能力受到影響，導(dǎo)致藥物敏感性下降。因此，臨床上在選擇有效抗菌藥物時(shí)，藥敏試驗(yàn)是一個(gè)必要的途徑，通過選擇對治療MDR-PA感染有效的藥物組合，可以避免濫用抗生素造成的耐藥率不斷升高以及醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

藥物之間的相互作用從藥效學(xué)上分為協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗4種，通過計(jì)算FIC指數(shù)可以評(píng)價(jià)藥物聯(lián)合所產(chǎn)生的效應(yīng)，本研究的8組配對藥物中有7組聯(lián)合藥物每組的兩種藥物之間藥效學(xué)主要表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用，當(dāng)這兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)就會(huì)對單一藥物難治的MDR-PA感染有效。而頭孢吡肟與環(huán)丙沙星聯(lián)合組的兩種藥物之間藥效主要表現(xiàn)為無關(guān)作用(占71.9%)，因此在臨床上盡量避免使用。

總之，通過聯(lián)合藥敏試驗(yàn)選擇有效的藥物聯(lián)合抑制或殺滅MDR-PA是臨床治療MDR-PA感染的有效方案，避免無關(guān)及拮抗藥學(xué)效應(yīng)的聯(lián)合藥物在臨床上的使用。