宮瑞澤，趙 卉，曲 迪，王燕華,2，張 磊，劉 暢，劉政波，孫印石,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

鹿茸（Cornu Cervi Pantotrichum）是鹿科動物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或馬鹿（C. elaphus Linnaeus）雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的作用[1]。商品鹿茸常見的產(chǎn)地加工方法有煮炸、凍干、排血和帶血；按切制部位分成蠟片、粉片、紗片和骨片[2]；炮制品有鹿茸粉和鹿茸片[1]。本課題組前期對不同產(chǎn)地加工方法、不同部位及不同炮制品鹿茸中的粗蛋白、氨基酸、脂肪酸、多糖、硫酸軟骨素、礦質(zhì)元素、核苷、生物胺等[3-9]成分進行了比對分析，結(jié)果表明不同加工方法、部位及炮制方法對鹿茸上述化學成分均有較大影響。

目前，鹿茸的質(zhì)量控制標準匱乏，缺乏統(tǒng)一的標準評價質(zhì)量。膠原蛋白是動物組織中一種特有的重要結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白的25%～30%，個別組織其質(zhì)量分數(shù)可高達50%以上[10-11]，主要存在于動物結(jié)締組織（皮膚、肌肉）、骨骼、軟骨等[12-14]，研究表明，膠原蛋白具有促進傷口愈合、潤滑關節(jié)等[15]功能，同時也與組織的衰老及鈣化密切相關[16-18]。膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)中以甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp）等氨基酸殘基為主，其中Gly含量最高，約占總氨基酸的25%～30%，故通常采用（Gly-X-Y）n表示膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)，其中X通常指Pro，Y通常指Hyp[19-20]。有研究表明[1]采用異硫氰酸苯酯柱前衍生高效液相色譜法可測定阿膠、龜甲膠和鹿角膠等膠類藥材中構(gòu)成膠原蛋白的主要氨基酸Gly、Ala、Pro和Hyp，進而對飲片質(zhì)量進行控制[1]。

膠原蛋白是一類分子質(zhì)量在2～300 kDa的生物大分子，無法通過儀器直接檢測。利用酸法、堿法和酶法等方法提取后折算樣品中的膠原蛋白含量，受提取率、樣品基質(zhì)效應等的影響，誤差較大。Hyp是構(gòu)成膠原蛋白的特異性氨基酸，不參與其他蛋白質(zhì)的合成，約占膠原蛋白含量的10%。在膠原蛋白的合成過程中，已合成肽鏈中的Pro被羥化酶轉(zhuǎn)化成Hyp。Hyp是一種亞氨基酸，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無紫外吸收和熒光特性，可以通過測定Hyp的含量進而轉(zhuǎn)化成膠原蛋白的含量。Hyp的檢測通常采用比色法和柱前衍生高效液相色譜法，比色法靈敏度低、穩(wěn)定性差，柱前衍生高效液相色譜法操作步驟繁瑣、衍生后干擾物質(zhì)較多[21-22]。氨基酸自動分析法是一種快速、準確、靈敏度高的測定方法，適用于構(gòu)成膠原蛋白的Gly、Ala、Pro和Hyp等多種氨基酸的分析[23]。

趙玉紅等[24]對不同生長階段鹿茸中的膠原蛋白含量進行比較，結(jié)果表明鹿茸二杠較毛桃和三岔含有更多的膠原蛋白，但鮮見不同產(chǎn)地加工方法、部位及炮制品鹿茸中膠原蛋白含量的報道。本研究建立以氨基酸自動分析儀測定組成膠原蛋白的4 種氨基酸含量，進而轉(zhuǎn)化為膠原蛋白含量的方法，并應用該方法研究不同產(chǎn)地加工、部位及炮制方法對鹿茸中膠原蛋白含量的影響。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地加工及炮制方法對鹿茸中膠原蛋白含量的影響較大。該方法的建立為鹿茸產(chǎn)地初加工及質(zhì)量評價和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮鹿茸21 對，購于吉林省長春市雙陽區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所李春義研究員鑒定為梅花鹿的茸角（二杠）。

L-羥脯氨酸（Hyp，批號：Z26M7H11979）、L-脯氨酸（Pro，批號：S30J6G1）、甘氨酸（Gly，批號：SM0315GA14）、L-丙氨酸（Ala，批號：S20A6G17672）（純度均≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；不同pH值檸檬酸鈉緩沖鹽、茚三酮衍生化試劑 日本日立公司；鹽酸、檸檬酸鈉（均為分析純）北京化工廠；超純水（電阻率≥18.25 MΩ·cm）由實驗室超純水機制備。

1.2 儀器與設備

L-8900高效全自動氨基酸自動分析儀 日本日立公司；EX125D2H電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HH-4A數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；FW177中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；0.22 μm水系（聚醚砜）針頭式過濾器 天津市津騰實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同產(chǎn)地加工及炮制方法鹿茸的制備

參考文獻[25]的方法，隨機選取鮮鹿茸6 對進行沸水煮炸與冷凍干燥的對比加工，另外6 對進行排血茸與帶血茸的對比加工。隨機選取其中3 對煮炸茸與凍干茸和3 對排血茸與帶血茸進行整支粉碎。將剩余的6 對鹿茸按蠟片、粉片、紗片和骨片進行分段、切片、粉碎、過篩（60 目）；剩余9 對鹿茸按傳統(tǒng)工藝進行沸水煮炸加工，將加工好的鹿茸分成A、B、C 3 組，每組3 對，每對鹿茸的2 支分別參照文獻[1]方法炮制加工成鹿茸粉和體積分數(shù)分別為40%、50%、60%的乙醇溶液潤制鹿茸片，鹿茸片進一步粉碎、過篩（60 目）。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取一定量的Hyp、Pro、Gly和Ala對照品置于50 mL容量瓶中，用檸檬酸鈉緩沖液（檸檬酸鈉19.6 g，加超純水稀釋到1 000 mL，用鹽酸調(diào)pH值至2.2）定容，混勻，配成各氨基酸組分質(zhì)量濃度為100 ng/mL的對照品儲備液，4 ℃低溫保存。

1.3.3 供試品溶液的制備

準確稱取制備好的鹿茸樣品30.0 mg（約合20.0 mg蛋白質(zhì)）于氨基酸水解管中，每個樣品3 份。加20 mL 6 mol/L的鹽酸后密封水解管，將水解管置于110 ℃恒溫干燥箱中，水解24 h。取出冷卻至室溫后離心，用移液器吸取800 μL上清液至蒸發(fā)皿中水浴70 ℃條件下蒸發(fā)至干，殘留物用2 mL上機用檸檬酸鈉緩沖液復溶，后用0.22 μm水系濾膜過濾，作為供試品溶液。

1.3.4 色譜條件

表1 氨基酸自動分析儀氨基酸梯度洗脫及茚三酮柱后衍生化程序Table 1 Amino acid gradient elution and postcolumn ninhydrin derivatization procedure

續(xù)表1

強酸型氨基酸自動分析儀專用離子交換色譜柱（4.6 mm×60 mm）；No.2622不銹鋼柱加保護柱；柱溫57 ℃；反應池溫度135 ℃；流動相：B1～B4為不同pH值的檸檬酸鈉緩沖溶液，B5為水（清洗流動相），B6為再生溶液（清洗樣品），B1～B6由泵1控制，流速為0.400 mL/min；R1～R3是茚三酮衍生化劑及其緩沖溶液，由泵2控制，流速為0.350 mL/min；氨基酸梯度洗脫及茚三酮柱后衍生化程序參考GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》及相關文獻方法[7,26]，具體洗脫程序見表1；其中Hyp和Pro經(jīng)茚三酮衍生后顯黃色，在440 nm波長處有最大吸收，Gly和Ala經(jīng)茚三酮衍生后顯藍紫色，在570 nm波長處有最大吸收；進樣體積20 μL。

1.3.5 方法學考察

1.3.5.1 線性關系、檢出限與定量限測定

精密吸取1.3.2節(jié)的氨基酸混合對照品儲備液，加入機用檸檬酸鈉緩沖液稀釋成系列梯度，按1.3.4節(jié)色譜條件進樣測定各氨基酸的峰面積，每個質(zhì)量濃度平行進樣3 次。以各氨基酸質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積的平均值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程。將1.3.2節(jié)對照品儲備液加入機用檸檬酸鈉緩沖液逐級稀釋后，按信噪比為3的對照品溶液質(zhì)量濃度為檢出限，以信噪比為10的對照品溶液質(zhì)量濃度為定量限。

1.3.5.2 精密度測定

精密吸取同一質(zhì)量濃度（100 ng/mL）的氨基酸混合對照品溶液20 μL，按1.3.4節(jié)色譜條件進行分析，連續(xù)進樣5 次，測定各氨基酸峰面積及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5.3 重復性測定

精密稱取同一鹿茸樣品（煮炸茸整支）6 份，每份30.0 mg，按1.3.3節(jié)方法制得供試品溶液，精密吸取6 份供試品溶液各20 μL，按1.3.4節(jié)色譜條件進樣分析，測定各氨基酸峰面積，通過回歸方程計算樣品中各氨基酸含量及RSD。

1.3.5.4 穩(wěn)定性測定

精密吸取1.3.3節(jié)制備的鹿茸（煮炸茸整支）供試品溶液20 μL，分別在0、2、4、8、16、24 h按1.3.4節(jié)色譜條件進樣分析，測定各氨基酸峰面積，考察儀器穩(wěn)定性。

1.3.5.5 回收率測定

精密稱取已知4 種氨基酸含量的鹿茸樣品（煮炸茸整支）粉末9 份，每份15.0 mg，分成低、中、高3 組，每組3 個平行，按照低、中、高水平加入適量的4 種氨基酸混合對照品，按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.4節(jié)色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算膠原蛋白含量及回收率。

1.3.6 膠原蛋白含量的計算

鹿茸樣品中膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)按下式計算：

式中：A為通過標準曲線得到的樣品中Hyp的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；m為稱取鹿茸的質(zhì)量/mg；50為氨基酸水解液定容后的體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白測定方法的選擇

圖1 4 種氨基酸混合標準品（A）和鹿茸樣品（B）色譜圖Fig. 1 Chromatograms of mixed standard of four amino acids (A) and velvet antler sample (B)

采用酸水解法將鹿茸樣品中的膠原蛋白水解成游離態(tài)氨基酸，后經(jīng)氨基酸自動分析儀測定構(gòu)成膠原蛋白的4 種氨基酸Gly、Ala、Pro和Hyp含量（圖1），參考趙玉紅[24]和貢雯玉[27]等的方法按照Hyp的含量換算膠原蛋白含量，進而分析不同產(chǎn)地加工方法、部位和炮制方法對鹿茸中膠原蛋白的影響。

評估方法：以地區(qū)統(tǒng)調(diào)負荷最高時點校驗10（20）千伏負荷組“N-1”，負荷組“N-1”校驗通過率（%）=通過“N-1”校驗的負荷組數(shù)/負荷總組數(shù)，對未通過“N-1”校驗的負荷組進行原因分析，并與上一年負荷組“N-1”校驗通過率實績值進行比對，對降低的情況進行原因分析，提出解決建議和規(guī)劃方案。

2.2 方法學考察結(jié)果

表2 4 種氨基酸的回歸方程、相關系數(shù)（R2）、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges,limits of detection and limits of quantification of four amino acids

4 種氨基酸的回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限見表2。精密度實驗結(jié)果，Hyp、Pro、Gly和Ala的RSD分別為1.78%、1.99%、2.01%和2.17%，表明氨基酸自動分析儀精密度良好；重復性實驗結(jié)果，Hyp、Pro、Gly和Ala的RSD分別為1.82%、2.03%、1.74%和2.81%，表明本實驗重復性良好；穩(wěn)定性實驗結(jié)果，Hyp、Pro、Gly和Ala峰面積的RSD分別為1.86%、2.14%、1.78%和2.41%，表明氨基酸自動分析儀在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收實驗結(jié)果，膠原蛋白的回收率介于95.74%～102.35%之間，RSD小于5%，表明加樣回收率良好。

2.3 凍干茸與煮炸茸4 種氨基酸及膠原蛋白含量

表3 凍干茸與煮炸茸中4 種氨基酸含量Table 3 Contents of four amino acids in freeze-dried and boiled velvet antler

圖2 煮炸茸與凍干茸中膠原蛋白含量Fig. 2 Collagen contents in boiled and freeze-dried velvet antler

由表3和圖2可知，通過對比煮炸茸和凍干茸不同部位鹿茸中構(gòu)成膠原蛋白的4 種氨基酸Hyp、Pro、Gly和Ala發(fā)現(xiàn)，4 種氨基酸中Gly含量最高，Pro、Ala和Hyp依次遞減。鑒于Hyp為膠原蛋白中的特異性氨基酸，因此采用其含量對膠原蛋白含量進行換算，但通過對其他3 種氨基酸比較發(fā)現(xiàn)三者表現(xiàn)出如下特點：同一部位煮炸茸高于凍干茸（除蠟片、骨片）；蠟片含量較高，粉片、紗片和骨片含量逐漸增大（除Ala）。凍干茸蠟片、粉片、紗片、骨片和整支中膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為37.43%、30.01%、32.16%、40.81%和36.47%；煮炸茸相應部位膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為31.40%、31.59%、35.69%、44.07%和39.44%。對于煮炸茸和凍干茸，除蠟片和粉片外，煮炸茸紗片、骨片和整支中膠原蛋白的含量均顯著高于相同部位的凍干茸（P＜0.05）；對于同一加工方法的不同部位，凍干茸蠟片中膠原蛋白含量顯著高于粉片、紗片（P＜0.05），與骨片無顯著性差異（P＞0.05），粉片、紗片和骨片中膠原蛋白含量逐漸增加；煮炸茸蠟片中膠原蛋白含量與紗片無顯著差異（P＞0.05），粉片、紗片和骨片中膠原蛋白含量逐漸增加。鹿茸的蠟片、粉片、紗片和骨片分別對應發(fā)育程度不同的軟骨組織[28]，其中蠟片部位對應分生組織旺盛的軟骨組織其膠原蛋白含量較高；粉片、紗片和骨片越靠近基部骨組織的發(fā)育越成熟，骨組織中含有大量的膠原蛋白，因此不同部位膠原蛋白含量呈現(xiàn)出粉片、紗片和骨片逐漸增加的規(guī)律。

2.4 排血茸與帶血茸4 種氨基酸及膠原蛋白含量

表4 排血茸與帶血茸中4 種氨基酸含量Table 4 Contents of four amino acids in unexsanguinated and exsanguinated velvet antler

圖3 排血茸與帶血茸中膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)Fig. 3 Collagen contents in unexsanguinated and exsanguinated velvet antler

由表4和圖3可知，通過對比排血茸和帶血茸不同部位鹿茸中構(gòu)成膠原蛋白的4 種氨基酸Hyp、Pro、Gly和Ala發(fā)現(xiàn)，Gly含量最高，Pro、Ala和Hyp含量依次遞減。排血茸和帶血茸相比，同一部位排血茸中4 種氨基酸顯著高于帶血茸（P＜0.05）（整支除外）；同一加工方法不同部位之間，排血茸和帶血茸中Hyp表現(xiàn)出蠟片含量較高，粉片、紗片和骨片含量逐漸增加的規(guī)律，帶血茸中Gly、Pro和Ala表現(xiàn)出蠟片、粉片含量較高，紗片、骨片含量逐漸增加的規(guī)律，排血茸中Gly表現(xiàn)出蠟片、粉片、紗片和骨片含量依次遞減的規(guī)律，Pro和Ala表現(xiàn)出蠟片、紗片含量較高，粉片、骨片含量依次遞減的規(guī)律。

排血茸蠟片、粉片、紗片、骨片和整支中膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為43.89%、39.04%、45.94%、46.23%和42.24%；帶血茸相應部位膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為37.84%、32.24%、35.11%、43.62%和37.64%。對于排血茸和帶血茸，同一部位排血茸中膠原蛋白的含量均顯著高于帶血茸（P＜0.05）（整支除外），排血茸加工過程中通過物理離心排出茸體內(nèi)的血液，血液中幾乎不含膠原蛋白，因此單位質(zhì)量的排血茸中膠原蛋白的含量高于帶血茸；對于同一加工方法的不同部位，排血茸蠟片中膠原蛋白含量顯著高于粉片（P＜0.05），與紗片無顯著性差異（P＞0.05），且顯著低于骨片（P＜0.05），粉片、紗片和骨片中膠原蛋白含量逐漸增加；帶血茸蠟片中膠原蛋白含量顯著高于粉片和紗片，且顯著低于骨片（P＜0.05），粉片、紗片和骨片中膠原蛋白含量逐漸增加，不同部位的軟骨組織其生長發(fā)育程度不同仍是造成不同部位膠原蛋白含量差異的主要原因。

2.5 炮制方法對鹿茸中4 種氨基酸及膠原蛋白含量影響

帶血煮炸加工后的每對鹿茸分成2 支分別按文獻[1]方法炮制，一支直接粉碎成鹿茸粉，另一支乙醇潤制后切制成鹿茸片后再干燥、粉碎。如表5所示，其中直接粉碎的3 組鹿茸粉膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為25.51%、24.93%和26.12%，采用40%、50%和60%乙醇溶液潤制的鹿茸片膠原蛋白含量分別為26.93%、28.89%和29.08%。

表5 鹿茸不同炮制品中4 種氨基酸和膠原蛋白含量Table 5 Contents of four amino acids and collagen in different processed products of velvet antler

由表5可知，通過乙醇潤制處理的鹿茸片中Hyp含量均高于未經(jīng)乙醇處理直接粉碎的鹿茸粉，40%乙醇溶液潤制的鹿茸片中Pro、Gly和Ala含量較未經(jīng)乙醇處理直接粉碎的鹿茸粉均有一定程度的減少，50%和60%乙醇溶液潤制的鹿茸片中Pro、Gly和Ala含量較未經(jīng)乙醇處理直接粉碎的鹿茸粉均有一定程度的增加。通過不同體積分數(shù)乙醇溶液潤制處理過的鹿茸片其膠原蛋白含量均顯著高于未經(jīng)處理直接粉碎的鹿茸粉，且隨著潤制鹿茸用乙醇溶液體積分數(shù)的增加，鹿茸片中膠原蛋白含量不斷增加。原因可能是鹿茸片加工過程中使用乙醇潤制，不同體積分數(shù)乙醇溶液中水占比較大，鹿茸中的游離氨基酸、無機鹽等物質(zhì)能被水溶出[9]，但膠原蛋白為生物大分子不易溶出，因此乙醇潤制后單位質(zhì)量的鹿茸中膠原蛋白含量增加；隨著乙醇溶液體積分數(shù)的增加其含水量降低對游離氨基酸、無機鹽等物質(zhì)的溶出能力減弱，因此隨著潤制鹿茸用乙醇體積分數(shù)的增加，鹿茸片中膠原蛋白含量不斷增加。

3 結(jié) 論

本實驗采用氨基酸自動分析法建立同時分析組成膠原蛋白的4 種主要氨基酸Hyp、Pro、Gly和Ala，通過膠原蛋白的特異性氨基酸Hyp定量膠原蛋白的含量，對比分析不同產(chǎn)地加工炮制方法和不同部位對鹿茸中膠原蛋白含量的影響，該方法具有專屬性強、穩(wěn)定性高、重復性好的特點，適用于鹿茸中膠原蛋白含量的分析和檢測。

通過比較不同產(chǎn)地加工、炮制方法和不同部位鹿茸中膠原蛋白含量的影響發(fā)現(xiàn)：不同產(chǎn)地加工方法對鹿茸中的膠原蛋白含量影響較大，煮炸茸中膠原蛋白含量高于凍干茸（蠟片除外），排血茸中膠原蛋白含量高于帶血茸；不同部位鹿茸之間表現(xiàn)出蠟片膠原蛋白含量較高，粉片、紗片和骨片中膠原蛋白含量依次遞增的規(guī)律；不同炮制方法的鹿茸炮制品中，乙醇潤制處理的鹿茸片中膠原蛋白含量高于直接粉碎的鹿茸粉，隨著潤制鹿茸乙醇溶液體積分數(shù)的增大鹿茸片中膠原蛋白含量逐漸增加。

綜上所述，僅以膠原蛋白含量評價鹿茸質(zhì)量，總體煮炸、排血產(chǎn)地初加工的鹿茸較凍干、帶血加工的鹿茸中膠原蛋白含量更高；鹿茸的蠟片、骨片較粉片、紗片含有更多的膠原蛋白；乙醇潤制的鹿茸片比直接粉碎的鹿茸粉更好地保留了鹿茸中的膠原蛋白。