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鰹魚黃嘌呤氧化酶抑制肽酶法制備工藝優(yōu)化

2019-12-04 08:04鄒琳杭妙佳李陽杜鵑馮鳳琴
關(guān)鍵詞:蛋白酶水解回收率

鄒琳,杭妙佳,李陽,杜鵑,馮鳳琴*

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,杭州310058;2.杭州康源食品科技有限公司,杭州310003)

高尿酸血癥是由嘌呤類物質(zhì)代謝紊亂或尿酸排泄減少引起的血尿酸升高的一種疾病[1]。長期尿酸過高對(duì)血管、心、腎均會(huì)產(chǎn)生一系列不良影響,增加了患高血壓、糖尿病、心腦血管疾病及腎臟疾病等的風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。目前,治療高尿酸血癥最常見的方法是服用化學(xué)合成的藥物,但長期服用易產(chǎn)生過敏、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、肝功能損害等毒副作用[5-6],因而開發(fā)食品來源的、低毒副作用的降尿酸物質(zhì)具有重要的臨床意義。

有研究發(fā)現(xiàn),芹菜素[7]、木犀草素[8]、槲皮素[9]等黃酮類物質(zhì),茶多酚[10]、白藜蘆醇[11]等酚酸類物質(zhì)及蓮堿[12]、甜菜堿[13]等生物堿類物質(zhì),具有較好的降尿酸作用。蛋白來源的小分子降尿酸肽具有制備成本低、安全性高、易吸收等特點(diǎn),已引起研究者的關(guān)注,成為降尿酸研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[14]。

目前,國內(nèi)外降尿酸活性研究聚焦于黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)抑制劑的篩選。XOD是體內(nèi)尿酸生成環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵酶[15]。以XOD 為靶點(diǎn)的抑制劑能夠直接與鉬蝶呤催化活性中心結(jié)合,阻斷尿酸的生成[16]。尿酸生成的同時(shí)會(huì)伴隨產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫[17],這會(huì)引發(fā)炎癥從而加重高尿酸血癥病情。研究表明,由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的二肽——肌肽及其類似物鵝肌肽,能清除活性氧及過氧化氫自由基,具有較強(qiáng)的抗氧化作用[18]。鰹魚(Katsuwonus pelamis),俗稱炸彈魚,屬于金槍魚科[19],具有高蛋白、低脂肪等特點(diǎn),但由于其肌纖維粗、腥味大而不宜生食,故常加工成罐頭,屬低值金槍魚[20]。而鰹魚肉含有豐富的肌肽及鵝肌肽[21],是制備降尿酸活性肽的良好來源。KUBOMURA等[22]通過人體試食試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),含有肌肽及鵝肌肽的鰹魚提取物能夠降低血尿酸水平。而肌肽及鵝肌肽是否通過抑制XOD 活性來發(fā)揮降尿酸作用尚不明確[22-23]。此外,由于發(fā)揮XOD 抑制活性的成分主要為小分子肽,而生物酶解技術(shù)是制備獲得小分子肽的有效途徑,因此,生物酶解技術(shù)可應(yīng)用于鰹魚XOD 抑制肽的制備。本研究以水解度、氮回收率、XOD 抑制活性、肌肽和鵝肌肽含量為指標(biāo),優(yōu)化鰹魚XOD抑制肽的酶法制備工藝,并分析探討肌肽及鵝肌肽與XOD抑制活性的關(guān)系,以期為工業(yè)化生產(chǎn)鰹魚XOD抑制肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:鰹魚由浙江省寧波今日食品有限公司提供,去除魚頭、內(nèi)臟、魚骨和魚尾后,剩下背腹肉,清洗干凈并絞碎,于-20 ℃條件下儲(chǔ)藏。

試劑:中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及胰酶,購自南寧龐博生物工程有限公司;黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、肌肽、鵝肌肽及乙腈(色譜級(jí)),購自美國Sigma公司。

儀器:Infinite M2000酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司),U3000 高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],Anke LXJ-IIB離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),F(xiàn)D-1C-50 冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鰹魚XOD 抑制肽的制備

將料水比1∶3的鰹魚背腹肉懸濁液在不同酶解條件下進(jìn)行酶解,結(jié)束后經(jīng)沸水浴滅酶15 min,冷卻,離心(5 000 r/min,30 min),收集上清液,測定其水解度及氮回收率;然后,冷凍干燥,于-20 ℃條件下貯藏,備用,測定凍干粉的XOD抑制活性(質(zhì)量濃度為8.8 mg/mL,以氮計(jì))、肌肽及鵝肌肽含量和分子質(zhì)量分布。

1.2.2 蛋白酶的篩選

分別用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰酶在其各自推薦的最適pH 和溫度條件下對(duì)鰹魚背腹肉進(jìn)行酶解。設(shè)定加酶量1 000 U/g、料水比1∶3、酶解時(shí)間5 h。蛋白酶活性、最適溫度和pH 見表1。以XOD 抑制活性、氮回收率和水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選出最佳蛋白酶。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以水解度、氮回收率、XOD抑制活性及肌肽、鵝肌肽含量為指標(biāo),進(jìn)一步考察加酶量、酶解溫度、酶解pH和酶解時(shí)間這4個(gè)因素的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),確定酶解制備鰹魚XOD抑制肽的最佳工藝。

表1 各蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

1.2.5 水解度測定

參考pH-Stat測定水解度的方法[24]。

1.2.6 氮回收率測定

采用凱氏定氮法(參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》)測定鰹魚背腹肉酶解后上清液中總氮含量。氮回收率計(jì)算公式如下:

式中:V為上清液體積,mL;N1為上清液中氮元素質(zhì)量濃度,g/mL;m為酶解時(shí)加入魚糜的質(zhì)量,g;N2為魚糜中氮元素質(zhì)量分?jǐn)?shù),g/g。

1.2.7 XOD 抑制活性測定

于96 孔板中每孔加入50 μL 待測樣品及50 μL濃度為0.02 U/mL 的XOD 溶液,振蕩30 s,于25 ℃條件下保溫5 min,加入150 μL 0.48 mmol/L 的黃嘌呤溶液,振蕩30 s后,于25 ℃條件下保溫25 min,測定在290 nm波長處的吸光度值。XOD抑制活性計(jì)算公式如下:

XOD抑制率/%=[1-(D1-D2)/(D3-D4)]×100.式中:D1為加酶樣品溶液的吸光度值;D2為不加酶樣品溶液的吸光度值;D3為用緩沖液代替樣品溶液的空白組的吸光度值;D4為不加酶空白組的吸光度值。

1.2.8 肌肽和鵝肌肽含量測定

采用高效液相色譜法測定肌肽和鵝肌肽含量。色譜柱:Sepax HP-amino(4.6 mm×250 mm,5 μm,江蘇省蘇州賽分科技有限公司)。流動(dòng)相:V[50 mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH 6.8)]∶V(乙腈)=4∶6;進(jìn)樣體積20 μL;流速1 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長210 nm;運(yùn)行時(shí)間25 min。

1.2.9 分子質(zhì)量測定

取鰹魚酶解凍干粉,用流動(dòng)相稀釋至2 mg/mL,采用凝膠色譜法測定肽的分子質(zhì)量分布。色譜柱:TSK gel 2000 SWXL分析柱(300 mm×7.8 mm,日本東曹株式會(huì)社)。流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=450∶550∶1;柱溫30 ℃;流速0.5 mL/min;檢測波長220 nm;運(yùn)行時(shí)間30 min。

標(biāo)準(zhǔn)肽樣品:細(xì)胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 511.44 Da)、維生素B12(1 355.37 Da)、氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)和還原型谷胱甘肽(307.32 Da)。用相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間擬合直線方程:

式中:y 為標(biāo)準(zhǔn)肽樣品相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù);x 為保留時(shí)間,min。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用Graphpad Prism 6 軟件作圖,采用SPSS 22.0、Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行方差分析,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選結(jié)果

用5種蛋白酶分別對(duì)鰹魚背腹肉進(jìn)行酶解,結(jié)果見表2。由于蛋白酶的專一性,不同蛋白酶的酶解位點(diǎn)并不相同,酶解得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)組成和XOD抑制活性也存在差異。其中,中性蛋白酶的XOD抑制活性、氮回收率和水解度均最高,分別達(dá)到了94.99%、97.57%和26.52%。因此,選用中性蛋白酶酶解鰹魚背腹肉并進(jìn)一步優(yōu)化XOD抑制肽的制備工藝。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對(duì)酶解效果的影響

在料水比為1∶3 時(shí),用中性蛋白酶在pH 為7.0和溫度為50 ℃條件下酶解鰹魚背腹肉5 h,考察不同加酶量對(duì)水解度、氮回收率、XOD 抑制活性及肌肽、鵝肌肽含量的影響。

由圖1可知:隨著加酶量的增加,反映鰹魚蛋白酶酶解程度的水解度逐漸上升,而氮回收率逐漸下降。這是因?yàn)樗舛群饬康鞍踪|(zhì)肽鏈的斷裂程度,而氮回收率則衡量水解對(duì)蛋白質(zhì)的增溶程度,當(dāng)水解達(dá)到一定程度時(shí),發(fā)生的酶解反應(yīng)主要是前階段蛋白質(zhì)水解獲得的肽進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為小肽和氨基酸,表現(xiàn)為水解度的增大,而氮回收率并不會(huì)增加[25],反而有可能因?yàn)樯珊休^多疏水性氨基酸的肽聚集沉降,導(dǎo)致氮回收率的降低[26]。當(dāng)加酶量為500 U/g 時(shí),XOD 抑制活性達(dá)最大值(64.42%)。而隨著加酶量的增加,鵝肌肽和肌肽含量在加酶量為4 000 U/g 時(shí)達(dá)到最大,與XOD 抑制活性在加酶量為500 U/g時(shí)達(dá)到最大不一致??紤]成本及氮回收率、XOD抑制活性,選擇500 U/g為最佳加酶量。

表2 不同蛋白酶對(duì)XOD抑制活性、氮回收率和水解度的影響Table 2 Effect of different proteases on XOD inhibition activity,nitrogen recovery and degree of hydrolysis

圖1 加酶量對(duì)鰹魚背腹肉酶解效果的影響Fig.1 Effect of enzyme dosages on enzymatic hydrolysis of dorsal and ventral muscle in skipjack tuna

2.2.2 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

在料水比為1∶3 時(shí),以500 U/g 的加酶量在pH為7.0 條件下酶解鰹魚背腹肉5 h,考察不同酶解溫度對(duì)水解度、氮回收率、XOD抑制活性及肌肽、鵝肌肽含量的影響。

圖2 酶解溫度對(duì)鰹魚背腹肉酶解效果的影響Fig.2 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis of dorsal and ventral muscle in skipjack tuna

酶解溫度能夠影響酶的活性及酶與底物反應(yīng)的速度。通常,在一定范圍內(nèi),溫度較高,酶促反應(yīng)速度較快,但酶失活的速度也較快,因此酶促反應(yīng)有一個(gè)適宜的溫度[27]。由圖2 可知,在45 ℃時(shí)酶解液水解度最高(P<0.05),在45 ℃和50 ℃條件下氮回收率最高(P<0.05),但在50 ℃時(shí)XOD抑制活性顯著高于在45 ℃時(shí)的活性(P<0.05),而肌肽和鵝肌肽含量在各酶解溫度下無顯著性差異(P>0.05),且與XOD 抑制活性的變化無關(guān)。綜合考慮氮回收率最高及XOD 抑制活性最高,以50 ℃為最佳酶解溫度。

2.2.3 酶解pH 對(duì)酶解效果的影響

在料水比為1∶3時(shí),以500 U/g的加酶量在溫度為50 ℃條件下酶解鰹魚背腹肉5 h,考察不同pH對(duì)水解度、氮回收率、XOD抑制活性及肌肽、鵝肌肽含量的影響。

pH 一方面影響酶的活性中心,另一方面影響底物的解離狀態(tài),使酶的空間構(gòu)象和底物的表面性質(zhì)發(fā)生改變,從而影響酶和底物的特異性結(jié)合[28],進(jìn)而影響特定功能肽段的生成量。中性蛋白酶的適宜pH 為5.5~7.5[29]。由圖3 可知:pH 在6.0~7.5范圍內(nèi),水解度、氮回收率和XOD 抑制活性均先增大后減小,且當(dāng)pH 為7.0 時(shí),氮回收率和XOD 抑制活性均達(dá)到最大值(P<0.05)。而鵝肌肽含量先降低后升高,肌肽含量逐漸升高,與XOD 抑制活性變化規(guī)律不一致。綜合考慮氮回收率和XOD 抑制活性,選定酶解的最佳pH為7.0。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

在料水比為1∶3 時(shí),以500 U/g 的加酶量在pH為7.0 和溫度為50 ℃條件下酶解鰹魚背腹肉,考察不同酶解時(shí)間對(duì)水解度、氮回收率、XOD 抑制活性及肌肽、鵝肌肽含量的影響。

圖3 酶解pH對(duì)鰹魚背腹肉酶解效果的影響Fig.3 Effect of pH on enzymatic hydrolysis of dorsal and ventral muscle in skipjack tuna

由圖4 可知:水解度隨著酶解時(shí)間的延長而先緩慢增大后緩慢減小,4 h時(shí),水解度達(dá)最大,酶解反應(yīng)基本結(jié)束,5 h 與4 h 時(shí)的水解度之間無顯著性差異(P>0.05)。這是由于隨著酶解反應(yīng)的不斷進(jìn)行,蛋白酶酶切位點(diǎn)逐漸減少,同時(shí),酶解產(chǎn)生的肽段會(huì)與魚肉蛋白競爭成為反應(yīng)底物,降低酶解效率[30]。氮回收率的變化趨勢與水解度基本一致,且酶解5 h時(shí)達(dá)到最大,為82.56%(P<0.05)。對(duì)比酶解4 h和5 h結(jié)果可知,XOD抑制活性和肌肽、鵝肌肽含量均無顯著性差異(P>0.05),且XOD抑制活性在5 h時(shí)達(dá)到最大,為63.48%。因此,綜合考慮氮回收率及XOD抑制活性,最佳酶解時(shí)間為5 h。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化模型的建立及方差分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在設(shè)定的因素范圍內(nèi),酶解時(shí)間對(duì)各指標(biāo)的影響不明顯,加酶量、酶解溫度和酶解pH 的影響相對(duì)明顯。因此,固定酶解時(shí)間為5 h,以水解度(Y1)、氮回收率(Y2)、XOD 抑制活性(Y3)及肌肽含量(Y4)、鵝肌肽含量(Y5)為響應(yīng)值,按照Box-Behnken原理,設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3 所示,試驗(yàn)結(jié)果見表4。

用Design Expert 8.0 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到水解度、氮回收率、XOD 抑制活性、肌肽和鵝肌肽含量對(duì)于加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)的二次回歸方程:

圖4 酶解時(shí)間對(duì)鰹魚背腹肉酶解效果的影響Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis of dorsal and ventral muscle in skipjack tuna

表3 酶解工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of response surface test for enzymatic hydrolysis optimization

對(duì)擬合的回歸模型方程進(jìn)行方差分析。以水解度為考量指標(biāo),其回歸模型極顯著(P=0.000 1<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.980 8>0.05),R2=0.972 8,且A、B2、C2為顯著性影響因素,各因素對(duì)水解度影響強(qiáng)弱順序?yàn)榧用噶浚久附鉁囟龋久附鈖H;氮回收率的回歸模型極顯著(P=0.000 4<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.274 6>0.05),R2=0.959 7,A、C、A2、B2、C2為顯著性影響因素,各因素對(duì)氮回收率影響強(qiáng)弱順序?yàn)榧用噶浚久附鈖H>酶解溫度;XOD抑制活性的回歸模型極顯著(P<0.001),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.386 2>0.05),R2=0.992 7,且A、C、BC、A2、B2、C2為顯著性影響因素,在各影響因素中,加酶量對(duì)XOD 抑制活性的影響最大,其次是酶解pH;肌肽含量的回歸模型無顯著性(P=0.077 4>0.05),與單因素試驗(yàn)中肌肽含量無明顯變化趨勢一致;鵝肌肽含量的回歸模型極顯著(P=0.002 4<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.080 1>0.05),R2=0.933 5,且A、C、AC、B2為顯著性影響因素,各因素對(duì)鵝肌肽含量影響強(qiáng)弱順序?yàn)榧用噶浚久附鈖H>酶解溫度。

2.3.2 響應(yīng)面圖分析

為了更直觀考察各因素之間的交互作用對(duì)水解度、氮回收率、XOD抑制活性、肌肽及鵝肌肽含量的影響,繪制各因素交互作用的三維(three dimensions,3D)響應(yīng)面圖,結(jié)果如圖5所示。

等高線的形狀可以反映各因素交互作用的顯著性,其中:橢圓形代表交互作用顯著,圓形代表不顯著,三維立體圖的陡峭程度反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響[31]。由圖5A可知:AB和AC的等高線不呈現(xiàn)橢圓形,BC的等高線變化坡度小,表明加酶量、酶解pH和酶解溫度的兩兩交互作用不顯著;由三維立體圖可知,在各因素中,加酶量對(duì)水解度的影響最為顯著,表現(xiàn)為響應(yīng)曲面坡度陡峭,隨著加酶量的增加水解度呈增大的趨勢,這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致,而酶解溫度和酶解pH的影響相對(duì)較弱,但其最佳水平都在試驗(yàn)范圍內(nèi)。

表4 酶解工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Response surface design and experimental results for enzymatic hydrolysis optimization

由圖5B可知:加酶量、酶解溫度和酶解pH的等高線近似為橢圓形,表明彼此之間均為顯著的交互作用;同時(shí)根據(jù)三維立體圖可知,3個(gè)因素的最佳水平均在試驗(yàn)范圍內(nèi)。加酶量對(duì)氮回收率的影響大于酶解溫度和酶解pH對(duì)氮回收率的影響,響應(yīng)曲面坡度陡峭。當(dāng)酶解溫度或酶解pH保持不變時(shí),隨著加酶量的增加,氮回收率呈先增大后減小的趨勢。

由圖5C 可知,鰹魚背腹肉酶解液的XOD 抑制活性的最大值出現(xiàn)在各因素的中心值處,說明加酶量過大、酶解pH過高、酶解溫度過高都不利于制備獲得具有較強(qiáng)XOD抑制活性的鰹魚肽,其原因可能是加酶量過大導(dǎo)致蛋白過度酶解,使有活性的肽段深度降解而失去活性,同時(shí)pH 和溫度過高影響中性蛋白酶活性,不利于酶解反應(yīng)的順利進(jìn)行。

結(jié)合圖5D和5E可知,酶解pH、加酶量和酶解溫度的交互作用對(duì)提高肌肽和鵝肌肽含量不顯著,這可能是肌肽和鵝肌肽是以游離的形式存在于細(xì)胞中[32],通過酶解可以一定程度裂解細(xì)胞,但是釋放程度與酶解條件無直接關(guān)系,這一結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果中各因素的變化與肌肽、鵝肌肽含量無直接相關(guān)性一致。

2.3.3 肌肽、鵝肌肽含量與XOD 抑制活性的相關(guān)性分析

由單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),肌肽、鵝肌肽含量與XOD抑制活性不存在明顯的量效關(guān)系。為了進(jìn)一步研究二者含量與XOD 抑制活性的相關(guān)性,對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析。

由表5可知,鰹魚背腹肉酶解產(chǎn)物的XOD抑制活性與肌肽或鵝肌肽含量無相關(guān)性,這表明鰹魚背腹肉酶解產(chǎn)物中具有XOD 抑制活性的是其他小分子肽。朱俊穎[33]提出,鵝肌肽的降尿酸機(jī)制在于它能夠激發(fā)次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,而這種酶能夠再次利用嘌呤,從而減少嘌呤代謝生成尿酸。因此,雖然肌肽或鵝肌肽含量高低不影響酶解產(chǎn)物的XOD抑制活性大小,但產(chǎn)物中含有較多肌肽或鵝肌肽仍然是體內(nèi)起到良好降尿酸作用所需要的。

2.3.4 酶解最優(yōu)工藝條件分析

利用Design Expert 8.0 軟件,以水解度、氮回收率、XOD 抑制活性、肌肽及鵝肌肽含量為響應(yīng)值并賦予相同的權(quán)重,得出酶解最優(yōu)條件:加酶量為489.86 U/g,酶解溫度為49.5 ℃,酶解pH 為7.08。此時(shí),對(duì)應(yīng)的水解度、氮回收率、XOD 抑制活性、肌肽和鵝肌肽含量(以干基計(jì))的預(yù)測值分別為23.69%、86.59%、64.56%、0.38%和1.36%。

基于XOD抑制活性與肌肽、鵝肌肽含量不存在相關(guān)性的結(jié)論,以水解度、氮回收率及XOD 抑制活性作為響應(yīng)值并賦予相同的權(quán)重,重新優(yōu)化酶解的最優(yōu)條件,得到最佳工藝:加酶量為522.78 U/g、酶解pH 為6.98、酶解溫度為49.9 ℃。此時(shí),對(duì)應(yīng)的水解度、氮回收率、XOD 抑制活性的預(yù)測值分別為24.76 %、87.15%、64.84%。

由于本文重點(diǎn)關(guān)注酶解制備獲得鰹魚XOD 抑制肽,因此不考慮水解度、氮回收率時(shí),得到的優(yōu)化工藝為:加酶量513.22 U/g、酶解pH 7.03、酶解溫度49.9 ℃。在此條件下,鰹魚酶解物XOD抑制活性預(yù)測值為64.94%。

綜合對(duì)比可知,在不同需求下得到的酶解工藝條件差別不大。因此,為驗(yàn)證試驗(yàn)預(yù)測結(jié)果,按5個(gè)響應(yīng)值的最佳酶解方法條件重復(fù)試驗(yàn)3 次,得到實(shí)際的水解度為22.38%,氮回收率為83.31%,XOD抑制活性為62.26%(以氮含量計(jì)),肌肽和鵝肌肽含量分別為0.05%和2.45%??梢姡摶貧w模型可以較好地預(yù)測鰹魚蛋白的酶解情況。

2.4 肽分子質(zhì)量分布

利用高效液相色譜法測定最佳條件下制備的鰹魚背腹肉酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布情況,結(jié)果見圖6。酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大于3 000 Da的組分僅占0.17%,超過95%組分的分子質(zhì)量低于1 000 Da,說明酶解液中發(fā)揮XOD 抑制活性的物質(zhì)主要是小分子的肽段。LI等[34]以核桃粉為原料,通過酶解制備、分離純化及分析鑒定后得到2個(gè)分子質(zhì)量小于1 000 Da 的肽段,它們均能阻止底物進(jìn)入XOD 疏水基團(tuán)通道,從而抑制XOD 活性。MUROTA 等[35]利用堿性水解酶水解鯊魚軟骨得到的XOD 抑制肽是分子質(zhì)量為686.64 Da 的五肽,與酶解粗提物相比,其XOD抑制活性提高了50倍。HE等[36]從鰹魚酶解物中分離鑒定出13種具有XOD抑制活性的二肽和三肽,其分子質(zhì)量均小于1 000 Da。本研究結(jié)果與他們的報(bào)道相類似。

圖6 鰹魚背腹肉酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布情況Fig.6 Molecular mass distribution of hydrolysates of dorsal and ventral muscle in skipjack tuna

3 結(jié)論

本研究確定了酶解鰹魚制備XOD 抑制肽的最佳工藝:采用中性蛋白酶,加酶量為489.86 U/g、酶解pH 為7.08、酶解溫度為49.5 ℃,酶解時(shí)間為5 h。在此條件下,水解度為22.38%,氮回收率為83.31%,XOD 抑制活性為62.26%(以氮含量計(jì)),肌肽和鵝肌肽含量分別為0.05%和2.45%(以干基計(jì)),實(shí)測結(jié)果與預(yù)測值基本一致。由本法所得的鰹魚XOD抑制肽以分子質(zhì)量低于1 000 Da 的寡肽為主。此外,XOD 抑制活性與肌肽或鵝肌肽含量無相關(guān)性,推測鰹魚背腹肉酶解產(chǎn)物中具有XOD 抑制活性的是其他小分子肽。本研究表明,鰹魚是制備XOD抑制肽的優(yōu)質(zhì)來源,且優(yōu)化后的酶解工藝條件操作簡單,可為工業(yè)化生產(chǎn)鰹魚XOD抑制肽提供理論參考和技術(shù)支持。

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