耿牡丹，劉 俊，孫瑞芬，趙 鎰，石慧芹，蘇慧明，金 珂

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.包頭市果樹果品科學(xué)技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014045）

葡萄是我國重要的經(jīng)濟果樹，加速葡萄新品種培育對葡萄產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有舉足輕重的作用。我國葡萄育種途徑主要有實生選種、雜交育種、芽變選種、人工誘變育種等，其中雜交育種是最常用、也是成功率最高的育種手段，我國68%的優(yōu)良品種來源于雜交育種[1]。葡萄品種繁多，資源豐富，不同地域品種雜交導(dǎo)致葡萄品種命名混亂，同名異物或同物異名成為普遍現(xiàn)象，且葡萄具有閉花受精習(xí)性，在雜交育種中，可能由于人工去雄套袋的不及時或去雄不徹底等原因使后代中混有自交苗，造成真假雜交種苗混雜，使雜交育種效率降低。因此，就雜交種的真實性進行鑒定對葡萄新品種創(chuàng)制具有重要意義。

葡萄雜交后代的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)、同工酶及分子標(biāo)記等方法。形態(tài)學(xué)鑒定是傳統(tǒng)的鑒定方法，容易受環(huán)境條件和栽培措施的影響，且其周期較長；細胞學(xué)鑒定程序較煩瑣，技術(shù)水平要求高，對于染色體小且相似的個體難于準(zhǔn)確識別；同工酶標(biāo)記難以體現(xiàn)親緣關(guān)系近的雜種之間的差異，而且同工酶在植物體內(nèi)較敏感，其標(biāo)記結(jié)果易受取材多少、采樣部位、時間及環(huán)境條件等諸多因素的影響[2]；分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展提供了直接以DNA 圖譜的方式顯示、在基因水平上揭示雜交子代與父母本間的遺傳差異，標(biāo)記位點多、多態(tài)性高，且不受環(huán)境及發(fā)育等因素的影響，為雜交后代進行早期快速鑒定與選擇提供新的理論依據(jù)。王西平等[3]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)鑒定了我國野生葡萄毛葡萄商-24 與歐洲葡萄龍眼的F1代雜交種。樊秀彩等[4]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了山葡萄和河岸葡萄的種間雜交種。朱駿馳等[5]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了玫瑰香與紅地球的210 個雜交種后代。

SRAP 分子標(biāo)記是一種基于PCR 的分子標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記技術(shù)具有簡便、高效、快速、重復(fù)性好、多態(tài)性高、無須預(yù)知物種序列信息的特點，已成功地應(yīng)用于不同物種種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[6-8]、雜交種鑒定[9-10]、遺傳圖譜的構(gòu)建[11-12]以及重要性狀的標(biāo)記[13]等方面的研究。本研究采用SRAP 技術(shù)對3 對葡萄種間雜交組合紅提×紅玫瑰、紅提×貝達和紅提×貴妃的F1代實生苗進行雜種真實性鑒定，以建立有效的葡萄雜交種鑒定方法，從而為葡萄新種質(zhì)的創(chuàng)制提供輔助選擇手段。

1 材料和方法

1.1 植物材料

葡萄親本材料歐亞種品種紅提、紅玫瑰、貴妃和美洲種貝達幼嫩葉片采自內(nèi)蒙古包頭市沙爾沁村種植戶；紅提×紅玫瑰的2 個F1代實生苗、紅提×貝達的3 個F1代實生苗和紅提×貴妃的3 個F1代實生苗幼葉均采自內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院科技示范園13 號大棚。采集時間為2018年7月，采集的葉片于液氮中速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

植物基因組DNA 提取試劑盒、Loading Buffer購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix、瓊脂糖、核酸染料購自南京博爾迪生化試劑有限公司；50 bp DNA Ladder（Dye Plus）和100 bp DNA Ladder（Dye Plus）購自TakaRa 公司，其他常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 SRAP 引物序列

1.3 植物基因組DNA 提取與檢測

用植物基因組DNA 提取試劑盒提取各試驗樣品的基因組DNA，提取方法按照試劑盒說明書進行。提取的DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，通過超微量紫外分光光度計檢測DNA的濃度及純度后，將樣品DNA 濃度稀釋為20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SRAP-PCR 引物的篩選

用14 條正向引物和14 條反向引物組合成196對SRAP-PCR 引物（表1），以4 個親本材料的DNA為模板進行SRAP 擴增，每對引物重復(fù)3 次。SRAPPCR 反應(yīng)體系為12.5 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 6.25 μL，上游引物0.25 μL，下游引物為0.25 μL，dd H2O 4.75 μL，模板DNA 1 μL。PCR 擴增程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5 次；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描照相。將能夠擴增出清晰、穩(wěn)定的父本特異性條帶的引物，或在每對雜交組合的父、母本間能夠產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性條帶的引物作為鑒定F1代雜交種的SRAP 擴增引物。

1.5 F1 代雜交種的SRAP-PCR 分析

在SRAP-PCR 中，以擴增出父本特異性條帶的雜種確定為真雜種。以此為判定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定F1代雜交種的真實性有2 種情況：（1）有父本的特異條帶，有或無子代的特異條帶；（2）既有母本的特異條帶又有父本的特異條帶，有或無子代的特異條帶。如果只有母本和子代的特異條帶而沒有父本的特異條帶，則認為母本的自交種或假雜種。每對引物重復(fù)3 次SRAP 擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物基因組DNA 檢測

用植物基因組DNA 提取試劑盒提取4 份親本材料及8 份F1代植株葉片總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 條帶清晰且沒有明顯拖尾（圖1）；通過超微量紫外分光光度計檢測DNA 的濃度及純度，DNA 的A260/280比值均在1.8～2.0，說明所提DNA 完整性好，純度較高，符合后續(xù)試驗要求。將試驗樣品DNA 濃度稀釋為20 ng/μL，用于SRAP 擴增的模板。

圖1 葡萄基因組DNA 電泳結(jié)果

2.2 SRAP-PCR 引物組合篩選

由于SRAP 標(biāo)記或為顯性標(biāo)記或為共顯性標(biāo)記，在雙親中進行引物篩選時，無法判斷具有父本特異位點的類型是純合顯性位點還是雜合顯性位點，故至少需要3～5 個SRAP 標(biāo)記進行綜合分析。將14 條正向引物和14 條反向引物組合成196 對SRAP 引物組合，分別對3 對親本組合的父、母本進行SRAP-PCR 擴增，選擇在每對組合的父、母本間產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性條帶的引物，作為F1代雜交種鑒定的引物。經(jīng)過反復(fù)篩選，選出可以鑒定紅提×紅玫瑰及其F1代雜交種的引物有4 對（Me1/Em10、Me8/Em13、Me9/Em3 和Me9/Em10）；可以鑒定紅提×貝達及其F1代雜交種的引物有10 對（Me1/Em10、Me2/Em11、Me3/Em10、Me4/Em10、Me5/Em6、Me8/Em13、Me9/Em3、Me9/Em10、Me13/Em5 和Me14/Em3）；可以鑒定紅提×貴妃及其F1代雜交種的引物有4 對（Me1/Em10、Me2/Em11、Me5/Em6 和M8/Em13）。

2.3 紅提×紅玫瑰的F1 代雜交種鑒定

從篩選出的4 對SRAP-PCR 引物中選擇3 對進行紅提×紅玫瑰的2 個F1代雜交種的鑒定。以紅提（♀）、紅玫瑰（♂）以及紅提×紅玫瑰的2 個F1代植株基因組DNA 為模板，分別用引物Me1/Em10、Me9/Em3 和Me8/Em13 進行SRAP 擴增。在引物Me1/Em10 的擴增中，400～500 bp，2 個子代均有父本的特異條帶，說明有父本基因的滲入；子代2（2F1）在1 500 bp 以上還有1 條自己的特異條帶（圖2A，箭頭所示），說明在子代2 中產(chǎn)生了變異，符合真實雜交種的判定標(biāo)準(zhǔn)。在引物Me9/Em3 的擴增中，由圖2B 可知，2 個子代在700～800 bp 均有1 條父本的特異條帶，說明均有父本基因滲入；子代1（1F1）在1 000～1 500 bp 有1 條清晰的母本特異條帶，所以認為，2 個子代均為真雜種。在引物Me8/Em13 的擴增中，由圖2C 可知，2 個F1代植株均在1 000 bp 處和600～700 bp 分別有1 條清晰的父本特異條帶，在1 000～1 500 bp 有1 條清晰的母本特異條帶；子代2（2F1）在500～600 bp 和350～400 bp 各有1 條母本特異條帶，且子代2（2F1）在150 bp 處和150～200 bp既有1 條母本特異條帶，同時有1 條父本特異條帶。除此之外，子代1（1F1）在350～500 bp 還有4 條父本特異條帶，由此，進一步確定2 個F1代雜交種均為紅提×紅玫瑰的真雜種。

圖2 引物Me1/Em10（A）、Me9/Em3（B）和Me8/Em13（C）的SRAP-PCR 電泳結(jié)果

2.4 紅提×貝達的F1 代雜交種鑒定

從篩選出的10 對SRAP-PCR 引物中，隨機選取3 對（Me3/Em10、Me13/Em5、Me14/Em3）進行紅提×貝達的3 個F1代雜交種的鑒定。從引物Me3/Em10擴增的電泳圖（圖3A）可知，在500 bp 處，3 個F1子代均有1 條父本的特異條帶，且在700～800 bp、400～450 bp、300～350 bp 均有1 條母本的特異條帶；另外，在1 500 bp 處，子代2（2F1）有2 條母本特異條帶；在450 bp 處，子代1（1F1）有1 條母本特異條帶；在1 500 bp 以上、300～350 bp 位點處，子代1（1F1）各有1 條父本特異條帶，在150～200 bp，子代2（2F1）和子代3（3F1）均有1 條父本的特異條帶。引物Me13/Em5 擴增電泳結(jié)果顯示（圖3B），3 個子代在300～350 bp 均有父本的特異條帶，且在400 bp 處均有母本的特異條帶。所以，用引物Me13/Em5 很容易鑒定出3 個子代均為真雜種。用引物Me14/Em3 進行SRAP-PCR 反應(yīng)，電泳結(jié)果顯示（圖3C），3 個子代在200 bp 處均有父本的特異條帶，且子代1（1F1）和子代2（2F1）在1 500 bp 以上有1 條父本的特異條帶，子代1（1F1）和子代3（3F1）在600～700 bp 有1 條父本的特異條帶；子代1（1F1）和子代2（2F1）在接近700 bp 處均有1 條自己的特異帶型，所以，3 個子代均為紅提×貝達的真雜種。

2.5 紅提×貴妃的F1 代雜交種鑒定

從篩選出的4 對引物中，用其中3 對引物Me1/Em10、Me2/Em11 和Me5/Em6 對紅提（♀）、貴妃（♂）及其3 個F1代雜交種進行SRAP-PCR 分析。在引物Me1/Em10 的擴增電泳結(jié)果中（圖4A），子代2（2F1）和子代3（3F1）在700～900 bp 均有3 條父本特異條帶，子代1（1F1）在700～800 bp 有1 條父本特異條帶，子代1（1F1）和子代3（3F1）在1 000 bp 以上均有1 條父本特異條帶，說明3 個子代均有父本基因滲入。子代1（1F1）和子代3（3F1）在600 bp 處均有1 條母本特異條帶，子代2（2F1）在1 000 ～1 500 bp有1 條母本特異條帶，說明3 個子代均有母本特異條帶。除此之外，3 個子代分別在400～500 bp、500～600 bp、500 bp 處均有各自的特異條帶。子代既有父本特異型條帶又有母本特異型條帶，并且還有自己的特異條帶，所以，3 個子代無疑為紅提×貴妃葡萄的雜交種。在引物Me2/Em11 的擴增電泳結(jié)果中（圖4B），3 個子代在350 bp 處和250～300 bp 均有父本的特異條帶，子代3（3F1）在700 bp 處有自己的特異條帶。由于鑒定子代以擴增出父本的特異條帶為依據(jù)，所以，引物Me2/Em11 可以確定3 個子代均為真雜種。引物Me5/Em6 的擴增電泳結(jié)果顯示（圖4C），3 個子代在400～450 bp 和1 000～1 500 bp 均各有1條清晰可見的父本的特異條帶，且在700 bp 處均有1 條母本特異條帶；子代2（2F1）在1 000～1 500 bp 有1 條父本特異條帶，在接近1 500 bp 處還有1 條母本特異條帶。所以，引物Me5/Em6 也較容易將紅提、貴妃及其二者的雜交后代區(qū)別開來。

圖3 引物Me3/Em10（A）、Me13/Em5（B）和Me14/Em3（C）的SRAP-PCR 電泳結(jié)果

圖4 引物Me1/Em10（A）、Me2/Em11（B）和Me5/Em6（C）的SRAP-PCR 電泳結(jié)果

3 討論與結(jié)論

葡萄雜交育種是種質(zhì)創(chuàng)制的重要途徑。由于葡萄育種周期長、且自花授粉習(xí)性容易導(dǎo)致假雜種產(chǎn)生，因此，對雜交種進行早期鑒定、早期選擇是提高育種效率、節(jié)約育種成本、加速育種進程的重要環(huán)節(jié)。分子標(biāo)記輔助選擇則是快速、有效進行雜交種早期鑒定與選擇的手段。

SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)是由LI 等[14]開發(fā)，稱為序列相關(guān)擴增多態(tài)性。它是以雙引物擴增為基礎(chǔ)，旨在對基因組中的開放閱讀框架（ORF）進行擴增，因此能夠體現(xiàn)物種間基因的多態(tài)性，更能體現(xiàn)出個體間真實的親緣關(guān)系。本研究的3 對雜交組合中，紅提和貝達分別屬于歐亞種和美洲種，二者的親緣關(guān)系較遠，故196 對SRAP-PCR 引物中，可用于鑒別雙親和子代的SRAP 引物相對較多，為10 對；而紅提和紅玫瑰、紅提和貴妃均屬于歐亞種，親緣關(guān)系相對較近，故196 對引物中，可用于鑒別雙親及其后代的引物相對較少，紅提和紅玫瑰組合為4 對，紅提和貴妃組合也為4 對，這8 對引物同時可鑒定紅提和貝達及其二者的雜交后代。

本研究利用SRAP 技術(shù)，對紅提×紅玫瑰的2 個F1代實生苗、紅提×貝達的3 個F1代實生苗和紅提×貴妃的3 個F1代實生苗進行了真雜種的早期鑒定。我們的判定標(biāo)準(zhǔn)主要是依據(jù)父本特異條帶的產(chǎn)生，即父本遺傳信息的滲入。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合有母本特異條帶的擴增或者F1代實生苗中出現(xiàn)新的特異條帶（新帶型可能是不同等位基因上同源序列的遺傳重組）。在LI 等[14]的研究結(jié)果中，20%的SRAP 標(biāo)記為共顯性標(biāo)記。因此，本研究中有些雜交種只有父本的特異帶型，而沒有出現(xiàn)父母本標(biāo)記位點信息的疊加。通過反復(fù)試驗，篩選出能夠鑒定不同親本組合的F1代雜交后代的特異引物，表明采用SRAP 技術(shù)快速鑒定葡萄真?zhèn)坞s交種是可行的，這些相應(yīng)的引物可以繼續(xù)用來分別進行3 對親本組合的其他F1代雜交植株的鑒定。