張 銳，唐艾嘉，解繼紅，石鳳翎，3，4，趙 彥，3，4

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

披堿草屬（Elymus）是禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）內(nèi)種類最多、分布最廣的屬，廣義的披堿草屬包括近150 個種。披堿草屬牧草為中生-旱中生多年生優(yōu)良牧草，是草原和草甸的重要組成部分。披堿草具有抗寒、耐旱、耐堿、抗風(fēng)沙等特性，是重要的固沙草本植物，也是重要的牧草種質(zhì)資源，亦可為麥類作物遺傳改良提供優(yōu)異基因資源[1]。遺傳多樣性是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一，了解物種遺傳變異的大小、時空分布及其與環(huán)境條件的關(guān)系，有助于采取科學(xué)有效的措施來保護(hù)人類賴以生存的遺傳資源，可為植物的分類進(jìn)化研究提供有益的資料，進(jìn)而為植物育種和遺傳改良奠定基礎(chǔ)[2]。

DNA 指紋圖譜是先進(jìn)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，具有高分辨率、準(zhǔn)確穩(wěn)定，能夠可靠地鑒定出生物個體與群體之間的差異及特點(diǎn)。利用分子標(biāo)記技術(shù)建立DNA指紋圖譜對鑒別品種、品系和選擇雜交親本有著重要的意義[3-4]。ISSR（Inter-simple sequence repeat）是一種以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的高效分子標(biāo)記技術(shù)，由ZIETKIEWICZ 等[5]在1994年提出可用其來檢測SSR間DNA 的序列差異。ISSR 通過利用重復(fù)序列加選擇性堿基為引物，對基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，可使其多態(tài)性產(chǎn)物更為豐富，因而能夠提供更多的遺傳信息，此外還具有重復(fù)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)已應(yīng)用于分子指紋圖譜、居群遺傳分析和系統(tǒng)進(jìn)化等研究[6-8]。SRAP （Sequence-related amplified polymorphism）是由美國加州大學(xué)作物系LI 等[9]研究蕓薹作物時開發(fā)出來的一種新型分子標(biāo)記系統(tǒng)，它具有簡便、重復(fù)性好、易于分離條帶和測序、成本低等優(yōu)點(diǎn)。在SRAP標(biāo)記中，引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，它獨(dú)特的引物將其可檢測基因的開放閱讀框（ORF）區(qū)域設(shè)計(jì)成一種無須任何序列信息就能直接進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。目前，在植物遺傳圖譜構(gòu)建[10]、作物遺傳多樣性分析[11-12]、基因定位[9]及比較基因組學(xué)[13]等方面已成功應(yīng)用。

本研究利用SRAP 和ISSR 分子標(biāo)記，構(gòu)建26 份披堿草屬植物材料的DNA 指紋圖譜并進(jìn)行遺傳多樣性分析，從而篩選出適用于鑒定披堿草材料的分子標(biāo)記，同時獲得供試材料的遺傳背景信息及各材料間的親緣關(guān)系，以期為披堿草種質(zhì)資源收集、保護(hù)、育種及綜合評價研究工作提供資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究供試材料為26 份披堿草材料，其中包括國家審定登記的披堿草品種、地方品種和代表性的披堿草種質(zhì)資源（表1）。所有材料均于2017年6月8日采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁基地。各材料隨機(jī)取25 個單株，分別提取單株總基因組DNA，等量混合為DNA 池作為模板保存在-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 DNA 提取與檢測

采用天根植物基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測DNA 的純度及濃度，滿足實(shí)驗(yàn)要求，存放于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 ISSR 的PCR 擴(kuò)增和檢測

ISSR 擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為20 μL：2×Taq Master Mix（其組分含有0.1 U/μL Taq DNA Polymerase、2×PCR 反應(yīng)緩沖液、3 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs）10 μL，DNA 模板1 μL（20～30 ng/μL），引物1 μL（10 ng/μL），ddH2O 8 μL。引物由上海生工合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像儀上照相。

1.4 SRAP 的PCR 擴(kuò)增和檢測

SRAP-PCR 反應(yīng)液體積為20 μL：2×Taq Master Mix （其組分含有0.1 U/μL Taq DNA Polymerase、2×PCR 反應(yīng)緩沖液、3 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs）10 μL，DNA 模板1 μL，上下引物各加0.5 μL，ddH2O 8 μL，在ABIVERITI 梯度PCR 儀中進(jìn)行，SRAP 隨機(jī)引物由上海生工合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共5 個循環(huán)；再94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像儀上照相。

1.5 數(shù)據(jù)分析

在ISSR 和SRAP 電泳圖譜分析中，挑選比較清晰、重復(fù)性較好的條帶進(jìn)行分析，同時將試驗(yàn)中擴(kuò)增的每一個條帶均視為一個條帶，然后統(tǒng)計(jì)和計(jì)算擴(kuò)增的總條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)。根據(jù)條帶的有無分別記為1，0。本試驗(yàn)涉及的材料間的遺傳相似系數(shù)GS 值，依據(jù)Nei-Li 的方法進(jìn)行計(jì)算，其相關(guān)的計(jì)算公式為：

表1 供試材料

其中，Nij表示供試物種材料i 和j 中所共有的擴(kuò)增條帶的數(shù)目，Ni是材料i 中出現(xiàn)的擴(kuò)增條帶的數(shù)目，Nj表示材料j 中出現(xiàn)的擴(kuò)增條帶的數(shù)目[14]。此外，在分析軟件NTSYS 2.1 中，以不同材料間的遺傳相似系數(shù)GS 值為基礎(chǔ)，進(jìn)行聚類分析[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR 分子標(biāo)記多態(tài)性分析

試驗(yàn)采用ISSR 的分子標(biāo)記方法對26 份樣本篩選出了10 個擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較好的引物，分別 是UBC807、UBC808、UBC811、UBC818、UBC835、UBC840、UBC844、UBC845、UBC848 和UBC873。由表2可知，10 個引物共擴(kuò)增出95 個條帶，其中，90 個為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分率（PPL）為94.74%，平均每個引物擴(kuò)增出9.5 個條帶，9.0 條多態(tài)性條帶。擴(kuò)增片段長度集中在250～1 000 bp，擴(kuò)增的條帶數(shù)在4～16 個。ISSR 引物UBC848 對供試材料的擴(kuò)增圖譜見圖1。該引物共擴(kuò)增出14 個條帶，且均為多態(tài)性條帶，PPL 值為100%；類似的引物還有UBC807、UBC808、UBC840、UBC844 和UBC873，其擴(kuò)增的條帶也均為多態(tài)性條帶。

表2 ISSR 引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物UBC848 對供試材料的擴(kuò)增圖譜

2.2 SRAP 分子標(biāo)記多態(tài)性分析

利用SRAP 分子標(biāo)記方法對26 份披堿草材料篩選出了10 對擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較好的引物，分 別 是 me2 +em13、me3 +em4、me3 +em15、me4 +em13、me4+em14、me4+em16、me9+em12、me9+em14、me9+em15、me10+em1。由表3可知，10 對引物共擴(kuò)增出110 條清晰條帶，平均每對引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為11 條。其中，多態(tài)性條帶100 條，所占比率為90.91%，每對引物的平均多態(tài)性條帶數(shù)為10 條擴(kuò)增出的片段長度在50～400 bp。引物me4+em13 的擴(kuò)增圖譜見圖2。

2.3 遺傳相似系數(shù)與聚類分析

遺傳多樣性的高低可通過遺傳相似系數(shù)的大小來表達(dá)，種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)越小，彼此間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，說明遺傳多樣性豐富；反之，遺傳相似系數(shù)越大，彼此間親緣關(guān)系越近，則遺傳多樣性越低。本研究利用NTSYS 軟件，以Dice 遺傳相似系數(shù)（GS 值）為基礎(chǔ)，計(jì)算出26 份披堿草屬材料間的遺傳相似性系數(shù)變幅為0.57～0.89，平均值為0.73，種質(zhì)間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近程度不一，也說明供試披堿草材料間存在較為豐富的遺傳多樣性。其中，康巴垂穗披堿草和垂穗披堿草（CF025446）間的遺傳相似系數(shù)GS 值最高（0.893），親緣關(guān)系最近。察北披堿草和垂穗披堿草（CF030026）2 個品種間的遺傳相似系數(shù)GS 值最低（0.546），親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

依據(jù)遺傳相似性系數(shù)，采用UPGMA 法對ISSR和SRAP 標(biāo)記的26 份披堿草材料進(jìn)行聚類分析（圖3）。在GS 為0.67 處將26 份披堿草材料分為4 類。第1 類主要包括10 份披堿草材料：康巴垂穗披堿草、垂穗披堿草（CF025446）、青牧1 號老芒麥、垂穗披堿草（CF030026）、川草2 號老芒麥、青海湟源披堿草、同德老芒麥、⑥D(zhuǎn)Y、農(nóng)牧老芒麥和垂穗披堿草。其中，3 份來源于青海、2 份來源于四川、2 份來源于吉林、2 份來源于內(nèi)蒙古、1 份來源于新疆。第2 類包括9 份披堿草材料：紫芒披堿草、圓柱披堿草（DY）、甘南垂穗披堿草、圓柱披堿草（CF016717）、同德短芒披堿草、紫黑披堿草（CF016709）、青海短芒披堿草、紫芒披堿草（CF016976）和四川紅原老芒麥。其中，4 份來源于青海、3 份來源于甘肅、2 份來源于四川。第3 類包括5 份披堿草材料：察北披堿草、DY、天山披堿草、新疆伊犁垂穗披堿草和圓柱披堿草。其中，2 份來源于青海、2 份來源于新疆、1 份來源于河北。第4 類包括2 份披堿草材料：紫黑披堿草（CF16711）和紫芒披堿草（CF016977），分別來源于四川和內(nèi)蒙古，這2 份材料的遺傳背景與其他材料存在較大的差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表現(xiàn)出遺傳特異性。

表3 SRAP 引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物me4+em13 對供試材料的擴(kuò)增圖譜

2.4 指紋圖譜的構(gòu)建

2.4.1 ISSR 指紋圖譜的構(gòu)建 ISSR 引物UBC818對26 個披堿草材料的擴(kuò)增結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，該引物共擴(kuò)增出16 個多態(tài)性條帶，PPL 值為100%，所擴(kuò)增條帶清晰、豐富，且26 份材料分別擴(kuò)增出的條帶互不相同，能夠彼此區(qū)分，因此將引物UBC818 作為鑒別26 份披堿草材料的分子標(biāo)記，并建立了披堿草材料ISSR 指紋圖譜，其結(jié)果見表4。

2.4.2 SRAP 指紋圖譜的構(gòu)建 SRAP 引物me4+em16 對26 個披堿草材料的擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，這對引物共擴(kuò)增出16 個多態(tài)性條帶，PPL 值為100%，擴(kuò)增條帶清晰、豐富，且26 個樣本分別擴(kuò)增出的條帶互不相同，能夠彼此區(qū)分，因此引物me4+em16 可以作為鑒別這26 份披堿草材料的分子標(biāo)記，由此用該標(biāo)記建立了披堿草材料的SRAP指紋圖譜，其結(jié)果見表5。

圖3 26 份披堿草基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA 聚類結(jié)果

圖4 引物UBC818 對供試材料的擴(kuò)增圖譜

3 討論

遺傳多樣性是物種攜帶遺傳信息的總和，反映該生物在特定生存條件下基因的豐富程度，是育種研究工作中最有價值的物質(zhì)基礎(chǔ)，而親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建對于品種保護(hù)和新品種定向選育具有重要意義[16-17]。ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)都具有簡便、快速、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好等特點(diǎn)，在植物遺傳多樣性分析和遺傳作圖中有著廣泛的應(yīng)用。已有研究結(jié)果表明[14，18-19]，這些分子標(biāo)記對披堿草遺傳多樣性的分析很有成效，本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

表4 26 份披堿草材料的ISSR 指紋圖譜

圖5 引物me4+em16 對供試材料的擴(kuò)增圖譜

多態(tài)性百分率是衡量種群間遺傳變異情況的重要指標(biāo)。多態(tài)性百分率越高，遺傳背景越豐富，適應(yīng)能力越強(qiáng)，反之則弱。在本研究中，ISSR 和SRAP 標(biāo)記分別擴(kuò)增出較高的多態(tài)性條帶95 條和90 條，多態(tài)性條帶百分率（PPL）分別為94.74%和90.91%，這說明本研究中的26 份披堿草種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平比較豐富。鄭經(jīng)紅等[14]采用ISSR 技術(shù)對25 份西北高原的野生垂穗披堿草種質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示多態(tài)性條帶比率為70.8%；陳智華等[20]采用SRAP技術(shù)對來自我國四川、西藏、青海、新疆等地的68 份垂穗披堿草種質(zhì)進(jìn)行了多態(tài)性分析，結(jié)果顯示多態(tài)性條帶比率達(dá)85.39%。這些研究結(jié)果均說明供試披堿草材料具有豐富的遺傳多樣性。多態(tài)性條帶比率之所以有這樣的差別，原因可能是供試材料種類和來源地有所不同。

表5 26 份披堿草材料的SRAP 指紋圖譜

從供試材料的聚類圖可以看出，本研究中的供試材料的遺傳背景與其地理來源有一定的相關(guān)性，但并不是很明顯。比如，第1 類主要包括10 份披堿草材料，其中，3 份來源于青海、2 份來源于四川、2 份來源于吉林、2 份來源于內(nèi)蒙古、1 份來源于新疆。第2 大類中包括9 份披堿草材料，其中，4 份來源于青海、3 份來源于甘肅、2 份來源于四川。兩大類材料均集中分布在西北地區(qū)。這可能與本研究所用材料大部分來自地域廣闊、生境復(fù)雜的地區(qū)，各地理類群海拔、經(jīng)緯度、溫度、濕度和環(huán)境等都有差別，造成了較大的遺傳變異[20]。此外，還可能與不同種源材料異地引種選育、推廣利用有關(guān)，所以從DNA 水平鑒定，兼顧形態(tài)特征評價，才能準(zhǔn)確鑒定各品種和代表性種質(zhì)材料，理清各材料的親緣關(guān)系，為種質(zhì)材料的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究利用ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記對26 份披堿草材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，將供試材料聚為4 大類；利用篩選出的ISSR 引物UBC818 以及SRAP 引物me4+em16 構(gòu)建了DNA 指紋圖譜，可用于鑒別26 份供試材料。ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記能夠充分揭示披堿草不同品種（種質(zhì)）間存在的遺傳差異，均可用于披堿草種質(zhì)資源的遺傳評價、種質(zhì)鑒定等研究工作。