扈 順，高 婧，王 勇，王 永，席先梅，張 俊，周廣俊，李艾蘭

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.烏蘭察布市商都縣經(jīng)濟(jì)作物工作站，內(nèi)蒙古 商都 013450）

西芹（Apium gravedens L.）屬耐寒性蔬菜，原產(chǎn)于地中海沿岸地區(qū)，為傘形科芹屬的栽培種[1]。西芹性涼，莖葉含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)及多種維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，口感脆嫩并具有清淡的香味，具有降血壓、鎮(zhèn)靜、清腸利便、利尿消腫、治療糖尿病、痛風(fēng)、冠心病等作用[2]，被譽(yù)為保健蔬菜。內(nèi)蒙古特殊的冷涼氣候條件非常適宜西芹種植，該地區(qū)種植的西芹植株緊湊粗大、葉柄寬厚、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，深受?chē)?guó)內(nèi)外客商青睞。內(nèi)蒙古商都縣從1993年引進(jìn)西芹，已經(jīng)由起初的小面積栽培發(fā)展成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)之一，每年種植面積在0.13 萬(wàn)hm2左右，2014年商都西芹被審定為地理標(biāo)志產(chǎn)品。然而，隨著西芹種植面積的擴(kuò)大、耕作土地的有限和輪作年限的縮短，近年來(lái)以“黑心爛根”為癥狀的根腐類(lèi)土傳病害發(fā)生普遍，嚴(yán)重影響了西芹的產(chǎn)量與品質(zhì)。一般種植田發(fā)病輕時(shí)可造成20%～30%的產(chǎn)量損失，重度田塊可達(dá)60%～80%，甚至絕收，極大地影響了農(nóng)民種植西芹的積極性和收益的提高。根腐病已成為制約商都縣西芹產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一。目前，有關(guān)商都縣西芹根腐病方面的研究還鮮有報(bào)道，為明確根腐病原菌的種類(lèi)，有效地防治該病害，解決生產(chǎn)問(wèn)題，本研究針對(duì)商都縣西芹根腐病病原菌進(jìn)行分離純化，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌的種類(lèi)進(jìn)行鑒定，并對(duì)其致病性進(jìn)行測(cè)定分析，旨在為西芹根腐病的致病機(jī)理、藥劑篩選、抗病材料篩選、預(yù)測(cè)預(yù)警及綜合防治等方面深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016—2017年，從烏蘭察布市商都縣小海子鎮(zhèn)不同西芹種植田中采集發(fā)病的病株作為分離樣品，包裝好帶回實(shí)驗(yàn)室盡快分離，觀察并記錄田間病株的表現(xiàn)癥狀。

1.2 病原菌的分離和純化

病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法，選擇癥狀典型的西芹根莖部病健交界處組織作為分離病原菌的材料，用解剖刀將其切成0.3 cm×0.3 cm 的薄片狀病樣，將該病樣依次經(jīng)過(guò)75%酒精處理3～5 s，0.1%次氯酸鈉處理2～3 min，無(wú)菌水漂洗3 遍。將病樣晾干，在水瓊脂平板上培養(yǎng)到長(zhǎng)出菌絲，然后用解剖針挑取菌絲到PDA 培養(yǎng)基上（25±1）℃黑暗培養(yǎng)，待分離菌產(chǎn)孢后，采用單孢分離法[3]純化培養(yǎng)，4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 分離菌的致病性檢測(cè)

1.3.1 西芹葉柄接種試驗(yàn) 選擇健康的西芹葉柄作為接菌材料，首先用自來(lái)水沖洗、再用1%次氯酸鈉溶液處理10 min、無(wú)菌水清洗3 遍。在無(wú)菌環(huán)境下，向每個(gè)鋪有2 層滅菌濾紙的方形培養(yǎng)皿中倒入10 mL無(wú)菌水，以保持90%～95%的相對(duì)濕度，然后每皿放入4 個(gè)5 cm 長(zhǎng)的葉柄段。將在（25±1）℃下培養(yǎng)10 d的菌餅（5 mm）倒置于西芹葉柄中間部位，每個(gè)葉柄上接種1 個(gè)菌餅，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，5 次重復(fù)。在（25±1）℃培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)，觀察西芹葉柄的發(fā)病情況。

1.3.2 西芹盆栽灌根接種試驗(yàn) 將滅菌土和滅菌沙以1∶1（體積比）混勻放于營(yíng)養(yǎng)缽中（30 cm×25 cm），挑選健康飽滿的“文圖拉”西芹種子為試驗(yàn)材料，用自來(lái)水反復(fù)搓洗后，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡10 min和無(wú)菌水沖洗3 遍，然后將種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽中。待西芹幼苗長(zhǎng)至10 cm 時(shí)，剪去營(yíng)養(yǎng)缽底，并修剪幼苗須根。配制病原菌孢子懸浮液，孢子濃度為105個(gè)/mL，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽灌澆50 mL 孢子懸浮液置于平盤(pán)上正常培養(yǎng)，以加等量蒸餾水作為對(duì)照，每盆保留3 株西芹幼苗，3 次重復(fù)。觀察西芹幼苗長(zhǎng)勢(shì)，28 d 后調(diào)查發(fā)病情況。

通過(guò)上述接種試驗(yàn)后，再次對(duì)發(fā)病的西芹進(jìn)行病原菌分離，從培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征方面對(duì)分離到的菌株和從田間病樣分離得到的菌株進(jìn)行分析對(duì)比，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在PDA 培養(yǎng)基上對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同時(shí)期的菌落特征，并對(duì)病原菌的孢子形態(tài)鏡檢[4]，初步確定病原菌的分類(lèi)單元。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 病原菌基因組DNA 的提取參照SAGHAI 等[5]的CTAB 法。PCR 擴(kuò)增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTG-CGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為2 mmol/L 10×PCR 緩沖液5 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，Taq 酶1 U，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA 模板100 ng，ddH2O 補(bǔ)到50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。獲得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送北京厚生博泰公司進(jìn)行序列測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，獲得同源性較高的鐮孢菌ITS 序列，應(yīng)用DNAMAN 進(jìn)行序列比對(duì)分析，然后利用其構(gòu)建西芹根腐病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確病原菌系統(tǒng)進(jìn)化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病規(guī)律及病害癥狀

通過(guò)田間觀察發(fā)現(xiàn)，西芹在移栽定植后7～10 d開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病期持續(xù)40～50 d，主要為害西芹根部和莖基部。發(fā)病初期地上部分長(zhǎng)勢(shì)衰弱，開(kāi)始萎蔫，晴天中午更為明顯。被侵害部位初期產(chǎn)生紅褐色，幾天后變?yōu)樗畎岛稚蚝诤稚砍屎诤稚?，根莖切面維管束層明顯變色，呈褐色病變，葉片變黃，由下往上發(fā)展，但葉片不脫落。發(fā)病嚴(yán)重的植株病斑擴(kuò)展成濕腐狀，變黑不發(fā)臭，主根受害腐爛或壞死，側(cè)根少，葉片嚴(yán)重萎蔫，最后植株萎蔫枯死，容易拔出（圖1）。一般正茬地不發(fā)病，重茬地發(fā)病嚴(yán)重，隨著重茬次數(shù)增多，發(fā)病率逐漸增加。西芹種植田發(fā)病后出現(xiàn)缺苗斷壟現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)成片死亡。

圖1 西芹根腐病田間發(fā)病癥狀

2.2 病原菌的分離純化

病樣采自商都縣小海子鎮(zhèn)，從根莖部位的病健交界處共分離純化得到4 株病原菌，命名為QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1，進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 病原菌通過(guò)組織分離和單孢純化后，分別獲得QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1 共4 個(gè)菌株，其中2 個(gè)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征見(jiàn)圖2。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，這4 個(gè)菌株均形成圓形或近圓形菌落，邊緣整齊呈放射狀，開(kāi)始均為白色，生長(zhǎng)速度快。XY1 和QC-5 在PDA平板上培養(yǎng)，菌落突起絮狀，菌絲白色質(zhì)密，菌落白色，淺粉色至肉色；小型分生孢子著生于單生瓶梗上，大小為（7.8～15.3）μm×（3.5～5.6）μm，常在瓶梗頂端聚成球團(tuán)，單胞，卵形；大型分生孢子鐮刀形，大小為（14.6～38.5）μm×（4.5～5.9）μm，少許彎曲，多數(shù)為3 隔；厚垣孢子呈球形或近球形，間生或頂生，單獨(dú)或呈鏈狀，將菌株XY1 和菌株QC-5 初步鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。2QC-3 和QC-3在PDA 平板上培養(yǎng)，呈現(xiàn)白色絨毛狀圓形菌落；分生孢子有兩種形態(tài)，小型分生孢子由發(fā)育良好的小型分生孢子梗形成，大小為（6.7～10.2）μm×（3.1～4.8）μm，呈卵圓形至柱形，有1～2 個(gè)隔膜；大型分生孢子鐮刀形或長(zhǎng)柱形，大小為（15.3～34.8）μm×（4.3～5.6）μm，直或稍彎，有較多的橫隔；厚垣孢子球形，間生或頂生，將菌株QC-3 和菌株2QC-3 初步鑒定為茄病鐮刀菌（Fusarium solani）。

圖2 病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征

2.3.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 提取菌株QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1 的基因組DNA，利用真菌通用引物ITS1/ ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增5.8S 區(qū)段，4 個(gè)菌株都獲得520 bp 左右的條帶，將4 個(gè)菌株擴(kuò)增條帶的序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 分析，菌株XY1和菌株QC-5 與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的同源性達(dá)到100%（圖3），菌株2QC-3 和菌株QC-3與茄病鐮刀菌（Fusarium solani）的同源性為100%。根據(jù)LANDEWEERT 等[6]研究認(rèn)為真菌通過(guò)ITS 區(qū)域比對(duì)，序列相似性＞99%，鑒別為相同種；序列相似性介于95%～99%，鑒別為相同屬；序列相似性≤95%，鑒別為相同科。因此，鑒定菌株XY1 和菌株QC-5為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），菌株2QC-3 和菌株QC-3 為茄病鐮刀菌（Fusarium solani）。另外，從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了Fusarium lateritium、Fusarium acuminatum、Fusarium chlamydo-sporum 作為內(nèi)群，以向日葵黃萎菌Vd90（Verticillium dahliae）為外群，利用DNAMAN 軟件Maximum Likelihood 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（bootstrap 值大于50 被顯示，樹(shù)枝上方數(shù)值為bootstrap 值）。菌株XY1 和菌株QC-5 與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）聚在一個(gè)分支，菌株2QC-3 和菌株QC-3 與茄病鐮刀菌（Fusarium solani）聚在一個(gè)分支，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致（圖4）。因此，將該病害命名為西芹鐮刀菌根腐病。

圖3 在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST 比對(duì)結(jié)果

圖4 西芹根腐病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 病原菌的致病性

2.4.1 西芹葉柄接種 葉柄接種結(jié)果顯示，QC-3、QC-5、2QC-3 和XY1 均能在西芹葉柄上寄生，接種1 d 菌絲已經(jīng)開(kāi)始生長(zhǎng)，接種3 d 能使組織變色壞死，接種5 d 后葉柄上產(chǎn)生明顯褐色病斑，而對(duì)照沒(méi)有任何變化，說(shuō)明分離到的4 株病原菌均對(duì)西芹有致病性（圖5）。

圖5 葉柄接種后發(fā)病癥狀

2.4.2 西芹盆栽灌根接種 接種QC-3 、QC-5、2QC-3 和XY1 的西芹幼苗均可產(chǎn)生病癥。幼苗地上部分葉片變黃；洗根后，初步觀察到褐色斑點(diǎn)，暗褐色壞死斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大，導(dǎo)致側(cè)根斷裂、枯萎、斑腐，與田間根部發(fā)病癥狀一致。對(duì)照植株生長(zhǎng)正常，無(wú)發(fā)病癥狀（圖6）。

圖6 盆栽灌根接種后西芹發(fā)病癥狀

3 討論與結(jié)論

芹菜根腐病是由連作障礙引起的土傳病害，在主要種植區(qū)發(fā)生比較普遍，是制約生產(chǎn)發(fā)展的一個(gè)重要因素。關(guān)于芹菜根腐病已有一些報(bào)道，呂佩珂[7]研究認(rèn)為，芹菜黃化病由尖孢鐮孢菌芹菜專(zhuān)化型引起；內(nèi)蒙古太仆寺旗染病芹菜根系中分離出接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌萎蔫專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、芬芳鐮刀菌（Fusarium redolen） 及黃瓜萎蔫病菌（Plectosphaerella cucumerina）5 種致病菌，其中黃瓜萎蔫病菌在莖稈上的危害首次報(bào)道[8]。天津地區(qū)重茬地芹菜主要為鐮刀菌侵染，初步鑒定為茄病鐮刀菌（Fusarium solani）[9]。側(cè)雄腐霉菌（Pythium paroecandrum）可引起北京地區(qū)芹菜根腐病[10]。山東地區(qū)芹菜根部及莖稈病斑處分離到黃瓜萎蔫病菌能致病[11]。由此可見(jiàn)，多數(shù)報(bào)道認(rèn)為，引起芹菜根腐病的病原菌為鐮刀菌屬真菌，且隨著不同種植區(qū)地理環(huán)境和土壤性質(zhì)的變化，不同地區(qū)間芹菜根腐類(lèi)病害的致病病原菌種類(lèi)存在差異，根腐病病原菌的鑒定可為芹菜連作引起的病害防治提供一定的依據(jù)。

根腐病是一種真菌性病害，為商都縣西芹種植區(qū)的常見(jiàn)病害，已造成不同程度經(jīng)濟(jì)損失。西芹根腐病病原菌以傷口侵染為主，定植移栽的過(guò)程中對(duì)根有損傷，或其他的農(nóng)事操作容易導(dǎo)致根莖基部受到損傷，或地下害蟲(chóng)對(duì)根系危害，很容易被病原菌侵入。病原菌從根部為害植物，引起維管束病害后造成植株枯死。本試驗(yàn)從采集的病樣中分離獲得4 株病原菌，通過(guò)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測(cè)鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病鐮刀菌（Fusarium solani），這與其他地區(qū)芹菜根腐病報(bào)道有所差異，其原因可能是不同地區(qū)、不同菌株的生存環(huán)境不同所致。因此，本研究明確了商都縣西芹根腐病主要是由尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌侵染引起的，稱(chēng)之為西芹鐮刀菌根腐病，為該地區(qū)西芹根腐病的防治提供理論依據(jù)。但有關(guān)該病病原菌地域性的發(fā)生規(guī)律、侵染致病過(guò)程、致病機(jī)理、快速檢測(cè)方法、抗原篩選及防治措施等方面還需進(jìn)一步研究。