呂迎蘭 田玉婷 毛會(huì)秀 劉金虎 陶然 方園 畢建云 王集會(huì)

摘 ?????要：探索了地龍粉混合酶（彈性蛋白酶和胰蛋白酶）酶解最佳工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采取正交實(shí)驗(yàn)對(duì)地龍粉進(jìn)行酶解。以酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、加酶量為自變量，以地龍粉水解度為因變量，采用L9（43）正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響順序?yàn)椋篊>B>D>A。最佳酶解工藝條件為酶解時(shí)間8 h，酶解溫度55 ℃，pH=8，加酶量3 000 U，水解度達(dá)52.96%。

關(guān) ?鍵 ?詞：地龍粉;正交實(shí)驗(yàn);彈性蛋白酶;胰蛋白酶;水解度

中圖分類號(hào)：O657.3 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）06-1174-04

Abstract： In order to explore the optimum enzymatic hydrolysis process of earthworm powder mixed enzymes （elastase and trypsin），on the basis of single factor experiment， the enzymatic hydrolysis of earthworm powder was carried out by orthogonal experiment. Taking enzymolysis time，enzymolysis temperature，pH and enzymes amount as independent variables， and taking the DH of earthworm powder as dependent variable， L9（43） orthogonal experimental table was used to carry out the experiment. The results showed that the influence degree of those factors to DH of earthworm powder in turn was： pH> enzymolysis temperature> enzymolysis time> enzymes amount. The best process condition was as follows： the enzymolysis time 8 h， the enzymolysis temperature 55 ℃， pH=8， and enzymes amount 3 000 U. Under above conditions， the DH was up to 52.96%.

Key words： Earthworm powder; Orthogonal experiment; Elastase; Trypsin; DH

地龍，又名蚯蚓、曲蟮，為蚯蚓的干燥體。地龍是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥材，古典中記載其有平肝息風(fēng)、通經(jīng)活絡(luò)、平喘、利尿等作用[1，2]。近年研究表明，中藥地龍的化學(xué)成分有蚓激酶、蛋白質(zhì)、氨基酸等，其中包括了人體必需的8種氨基酸[3]?，F(xiàn)代研究指出，地龍具有抗凝血、抗血栓、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[4]，其抗腫瘤作用成為研究熱點(diǎn)之一。

從古至今，地龍的炮制方法有酒制法、滑石粉炒制、蛤粉炒制、醋制等，臨床所用煎煮液存在服用量大、易被污染等不足[5]。有研究表明，動(dòng)物類藥材有效活性成分主要為小肽[6]。且從蛋白質(zhì)中得到的小肽，可作為研發(fā)和開(kāi)發(fā)新藥的先導(dǎo)物[7]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明地龍粉酶解最佳用酶為彈性蛋白酶和胰蛋白酶混合使用[8]。本實(shí)驗(yàn)擬采用此兩種酶混合使用，以溫度、時(shí)間、pH和酶用量為變量因素，以水解度為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化地龍粉酶解工藝。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?儀器[8]

FA1204B電子天平（上海天美天平儀器有限公司）;遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱（上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;PHS-25pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;ST 16R高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];UV9100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京萊伯泰儀器有限公司）;KQ-500GVDV型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 ?試劑

乙醇（無(wú)水乙醇）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;D-果糖（北京西中化工廠）;水合茚三酮（上海源聚生物科技有限公司）;彈性蛋白酶（ 上海源葉生物科技有限公司）;甘氨酸、胰蛋白酶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 ?供試品

地龍粉（批號(hào)：20180201），購(gòu)自安徽亳州。

2 ?實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 ?茚三酮顯色劑的配制[9]

分別精密稱取磷酸二氫鉀6.00 g，茚三酮0.50 g，磷酸氫二鈉10.00 g， D-果糖0.30 g，加蒸餾水置于燒杯中溶解，再定容至100 mL，得新鮮茚三酮顯色劑以備用。

2.1.2 ?甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的甘氨酸0.100 0 g，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容，用移液槍精準(zhǔn)取出2.00至100 mL容量瓶中定容，得20 ?g/mL 的溶液，分別從中取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL定容至10 mL，配成濃度為0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取2.00 mL稀釋液于干燥潔凈的具塞試管中，分別加入1.00 mL已配制好的新鮮茚三酮顯色劑，混勻后于100 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出后放冷至室溫，分別加入5.00 mL配制好的 40%乙醇溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）混勻，放置15 min，置于紫外可見(jiàn)可見(jiàn)分光光度計(jì)中，設(shè)定波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度A，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 ?地龍粉水提液的制備

精密稱取1.000 0 g地龍粉，置于100 mL干燥潔凈的具塞錐形瓶中，加30 mL蒸餾水，置于超聲提取器中，進(jìn)行超聲30 min，按照實(shí)驗(yàn)方案所設(shè)條件處理。酶解過(guò)程中保持溫度和pH值的恒定，pH值每隔1 h調(diào)1次。酶解結(jié)束，在4 ℃，3 000 r/min條件下離心10 min后進(jìn)行抽濾。所得濾液定容至100 mL，得供試品溶液。將供試品溶液按照2.1.2項(xiàng)方法測(cè)定水解度。

凱氏定氮法測(cè)定地龍凍干粉總氮量[10]。

2.3 ?水解度的計(jì)算

按照2.1項(xiàng)及2.2項(xiàng)方法可計(jì)算地龍粉中游離氨基含量，可得出地龍粉中總氮量，再換算為氨基含量。按照下列公式計(jì)算水解度（DH）。

水解度（DH）%=肽鍵數(shù)已水解/總肽鍵數(shù)原料中×100%=（B-C）/（A-C）×100%

式中：A為地龍粉中總氮數(shù);B為地龍粉經(jīng)蛋白酶酶解后的游離氨基氮數(shù);C為地龍粉水提液中游離的氨基氮數(shù)。

2.4 ?單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 ?pH對(duì)地龍粉水解度的影響

以地龍粉經(jīng)酶解后的水解度為參考標(biāo)準(zhǔn)，在固定酶解時(shí)間4 h，固定酶解溫度35 ℃，固定加酶量2 000 U的條件下，測(cè)定不同pH（6，7，8，9，10）水平下地龍粉的水解度。

2.4.2 ?溫度對(duì)地龍粉水解度的影響[11，12]

以地龍粉經(jīng)酶解后的水解度為參考標(biāo)準(zhǔn)，在固定pH=8，固定加酶量2000 U，固定酶解時(shí)間4h的條件下，測(cè)定不同溫度（40，45，50℃，55，60 ℃）水平下地龍粉的水解度。

2.4.3 ?時(shí)間對(duì)地龍粉水解度的影響

以地龍粉經(jīng)酶解后的水解度為參考標(biāo)準(zhǔn)，在固定酶解溫度35 ℃，固定加酶量2 000 U，固定pH=8的條件下，測(cè)定不同時(shí)間（4，5，6，7，8 h）水平下地龍粉的水解度。

2.4.4 ?加酶量對(duì)地龍粉水解度的影響

以地龍粉經(jīng)酶解后的水解度為參考標(biāo)準(zhǔn)，在固定酶解時(shí)間4 h，固定pH=8，固定酶解溫度35 ℃的條件下，測(cè)定不同加酶量（1 500，2 000，2 500，3 000 U，3 500 U）水平下地龍粉的水解度。

2.5 ?正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，各個(gè)因素篩選出三個(gè)水平，采用L9（43）正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)。

2.6 ?數(shù)據(jù)處理

使用spss軟件處理正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。

3 ?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

3.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線

以甘氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.467X+0.001 9（r2=0.998 6）。

用凱氏定氮法測(cè)得1.000 0 g地龍粉中總含氮量為52.048 mg。

3.2 ?單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 ?酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

據(jù)圖1可知，在4～6 h范圍內(nèi)，水解度呈現(xiàn)先升高，在6 h達(dá)最大，而后持平的趨勢(shì)。原因可能是在一定酶解時(shí)間內(nèi)，底物水解度與酶解時(shí)間呈正相關(guān)，在6 h時(shí)達(dá)到飽和。由于時(shí)間延長(zhǎng)，地龍粉逐漸被轉(zhuǎn)化，其中大分子蛋白質(zhì)被分解為小分子物質(zhì)[13];同時(shí)也與蛋白酶自身壽命有關(guān)[16]，兩者綜合影響導(dǎo)致水解度下降。因此選定6、7、8 h作為正交實(shí)驗(yàn)中地龍粉酶解時(shí)間的三個(gè)水平。

3.2.2 ?酶解溫度對(duì)水解度的影響

從圖2中可看出在35～60 ℃范圍內(nèi)，35～55 ℃時(shí)持續(xù)上升，55 ℃時(shí)水解度達(dá)最大，據(jù)此可推測(cè)彈性蛋白酶與胰蛋白酶混合后在55 ℃時(shí)的體外活性最佳。原因可能是溫度較低時(shí)酶的活力較低，而溫度過(guò)高酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)遭到永久性破壞，致使水解度降低[16]。因此選定50、55、60 ℃為正交實(shí)驗(yàn)中地龍粉酶解溫度的三個(gè)水平。

3.2.3 ?pH對(duì)水解度的影響

從圖3可看出在pH=6～10的這段范圍里，水解度先上升，到pH=8時(shí)達(dá)到最大，然后下降。有研究也表明彈性蛋白酶和胰蛋白酶的適宜pH為弱堿性環(huán)境[14-16]。因此選定pH=7、8、9為正交實(shí)驗(yàn)中地龍粉酶解所用pH的三個(gè)水平。

3.2.4 ?加酶量對(duì)水解度的影響

據(jù)圖4可知，在1 500～3 500 U范圍內(nèi)，水解度呈現(xiàn)先升高而后持平的趨勢(shì)，在3 000 U時(shí)達(dá)持平。表明在3 000 U時(shí)1.000 0 g地龍粉所需蛋白酶用量達(dá)到飽和。因此選定2 500、3 000、3 500 U為正交實(shí)驗(yàn)中地龍粉酶解所用加酶量的三個(gè)水平。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取四個(gè)因素（時(shí)間、溫度、pH、加酶量），每個(gè)因素選取三個(gè)水平，如表1所示。

3.4 ?最佳工藝條件的驗(yàn)證[17]

根據(jù)所篩選的最佳工藝條件（8 h，55 ℃，pH=8，3 000 U），在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為53.46%、52.76%、52.66%，平均值為52.96%。

4 ?討 論

地龍是傳統(tǒng)的蟲(chóng)類中藥，其主要成分為蛋白質(zhì)、氨基酸等。經(jīng)酶解工藝處理的蛋白質(zhì)，可降解成小分子肽和氨基酸[18]，具有毒性低、靶向性高、易吸收等優(yōu)勢(shì)[16]。在之前的研究工作中用五種蛋白酶對(duì)地龍粉進(jìn)行酶解，經(jīng)過(guò)篩選最終確定地龍粉酶解用佳酶為彈性蛋白酶和胰蛋白酶。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)采取彈性蛋白酶和胰蛋白酶混合使用來(lái)對(duì)地龍粉進(jìn)行酶解且對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳酶解工藝為A3B2C2D3，即酶解時(shí)間8 h，酶解溫度55 ℃，pH=8，加酶量為3 000 U，在此條件下水解度高達(dá)52.96%。且經(jīng)過(guò)方差分析，溫度、pH、加酶量、時(shí)間四種因素均為地龍粉酶解工藝的主要影響因素，這將為下一步制備新藥、抗腫瘤研究提供依據(jù)。

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