楊濤 陳舟舟 王海東 李亞軍 李繼安 雷翔霄 陳代杰 儲消和

(1 上海交通大學藥學院，上海 200240；2 浙江工業(yè)大學長三角綠色協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310014；3 常州方圓制藥有限公司，常州 2130125；4 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203)

氨基糖苷類藥物自1944年面世以來，其具有水溶性好、化學性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、抗菌能力強和吸收排泄良好等特點，是治療革蘭陰性菌和結核桿菌感染的首選藥物之一[1]。1963年美國Schering公司的Weinstein第一次從棘孢小單孢菌中分離得到慶大霉素(gentamicin)[2]。廣義上的慶大霉素是多組分的混合物，以C族復合物為主；主要從絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌中發(fā)酵分離獲得，其主要組分有C1，C1a，C2，C2a。其中以C1a和C2a的治療效果最好，但是易產(chǎn)生耐藥性；C1和C2治療效果一般，但是不易產(chǎn)生耐藥性[3]。

其中慶大霉素C1a單組分是我國一類新藥硫酸依替米星半合成的關鍵起始物料[4]，而市售的慶大霉素C1a游離堿一般HPLC純度都低于93%，嚴重影響依替米星質(zhì)量和生產(chǎn)過程雜質(zhì)控制。現(xiàn)有慶大霉素C1a生產(chǎn)工藝主要采用離子交換樹脂靜態(tài)和柱層析吸附-氨水解析法分離純化慶大霉素生產(chǎn)過程富集的慶大霉素C1a粗品(HPLC純度50%～60%)[5-6]，但其難以獲得高純度的慶大霉素C1a。

本研究團隊探索用大孔吸附樹脂層析法及鹽析結晶法精制純化硫酸依替米星起始物料—慶大霉素C1a成品(HPLC純度91%～93%)，獲得高質(zhì)量的慶大霉素C1a精制品。最終希望通過減少慶大霉素C1a中雜質(zhì)來減少依替米星中雜質(zhì)水平，獲得高質(zhì)量的硫酸依替米星API產(chǎn)品。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 材料

本實驗所用材料見表1。

1.1.2 儀器

本實驗所用儀器見表2。

1.2 方法

1.2.1 慶大霉素C1a的含量及純度測定

(1)慶大霉素C1a的含量測定：精密稱取本品適量，用水定量稀釋制成約含慶大霉素C1a 0.4mg/mL的溶液，作為供試品溶液；另取慶大霉素C1a對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素C1a 2.0mg/mL的溶液，作為對照溶液；精密量取對照溶液適量，用水定量稀釋制成含慶大霉素C1a各0.3、0.4和0.5mg/mL的溶液作為對照溶液(1)、(2)和(3)。照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部·通則0521)試驗，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(pH范圍0.8～8.0)；以0.2mol/L三氟醋酸溶液-甲醇(84:16)為流動相；流速為0.5mL/min；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測(參考條件：漂移管溫度105℃，載氣流速為2.6L/min，可根據(jù)具體情況適當調(diào)整條件)。精密量取對照溶液(1)、(2)和(3)各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照溶液濃度的對數(shù)值與相應的峰面積的對數(shù)值計算線性回歸方程，相關系數(shù)(r)應不小于0.99；另取供試品溶液，同法測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，扣除硫酸峰，用線性回歸方程計算供試品中慶大霉素C1a的含量。具體色譜參數(shù)參照依據(jù)中國藥典2015年版二部硫酸依替米星項下有關物質(zhì)第二法(LC-ELSD法)[7]。

表1 本實驗所用材料Tab.1 Materials used in this experiment

表2 本實驗所用儀器Tab.2 Instruments used in this experiment

(2)慶大霉素C1a的純度測定：精密稱取本品適量，用水定量稀釋制成約含慶大霉素C1a 2.0mg/mL的溶液，作為供試品溶液；另取慶大霉素C1a對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素C1a 2.0mg/mL的溶液，作為對照溶液，西索米星和小諾霉素的對照溶液配制方法相同；精密量取對照溶液適量，用水定量稀釋制成含慶大霉素C1a各20、50和100μg/mL的溶液作為對照溶液(1)、(2)和(3)。HPLC-ELSD方法同“(1)”，精密量取對照溶液(1)、(2)和(3)各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照溶液濃度的對數(shù)值與相應的峰面積的對數(shù)值計算線性回歸方程，相關系數(shù)(r)應不小于0.99；另取供試品溶液，同法測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，扣除硫酸峰，用線性回歸方程計算供試品中慶大霉素C1a純度。供試品溶液色譜圖中小于對照溶液主峰面積0.02倍的峰忽略不計。

1.2.2 大孔吸附樹脂柱層析

(1)色譜型大孔吸附樹脂的初篩：選用HZ色譜填料-50、色譜3號、NM100、NM200色譜型大孔吸附樹脂，每種樹脂經(jīng)預處理后分別裝1根柱體積約300mL的高徑比4:1的常壓層析柱純化慶大霉素C1a粗品。上樣液pH調(diào)至11.5，上樣量3g慶大霉素C1a粗品/ 100mL濕樹脂，上樣流速1BV/h，然后去離子水沖洗約3BV，流速0.2BV/h。接著采用pH1.6稀硫酸水解析，解析流速1.0BV/h，分步收集，每1BV收集1瓶，檢測收集液的比旋度，有比旋度的收集液用HPLC檢測含量和純度。考察不同樹脂純化慶大霉素C1a粗品后獲得純度大于96%收集液樣品的收率。

(2)NM200大孔吸附樹脂柱層析參數(shù)的優(yōu)化：①解析pH值的優(yōu)化 各取NM200樹脂500mL裝入3根與“(1)”相同規(guī)格的色譜柱備用。分別取3份15g慶大霉素C1a粗品溶解于300mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH11.5上柱吸附，流速1BV/h，然后去離子水沖洗約3BV，流速0.2BV/h。選取pH 1.8、2.0、2.2的稀硫酸水溶液解析，解析流速1.0BV/h，考察最優(yōu)解吸條件。洗脫液分步收集，每1BV收集1瓶，檢測收集液的比旋度，有比旋度的收集液用HPLC檢測含量和純度。考察不同解析pH下純化慶大霉素C1a粗品后獲得純度大于96%收集液樣品的收率。

②解吸流速的優(yōu)化：各取NM200樹脂500mL裝入3根與“(1)”相同規(guī)格的色譜柱備用。分別取3份15g慶大霉素C1a粗品溶解于300mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH11.5上柱吸附，流速1BV/h，然后去離子水沖洗約3BV，流速0.2BV/h。選取“①”條件較優(yōu)的稀硫酸水溶液解析，考察不同解析流速0.5、1.5和2.0BV/h對樹脂純化效果的影響。洗脫液分步收集，每1BV收集1瓶，檢測收集液的比旋度，有比旋度的收集液用HPLC檢測含量和純度?？疾觳煌馕隽魉傧录兓瘧c大霉素C1a粗品后獲得純度大于96%收集液樣品的收率。

1.2.3 鹽析結晶法精制慶大霉素C1a

(1)有機溶劑的種類和比例的初篩：分別選取甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇等與水互溶的有機溶液，與10mL含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液以4:1、7:1、10:1的比例混合均勻，加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0后于室溫中磁力攪拌3h考察慶大霉素C1a結晶情況。如有固體析出，送HPLC檢測其純度。

(2)加入硫酸調(diào)節(jié)pH先后順序的考察：選取2份10mL含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液，按照“(1)”結晶較好的溶劑種類和7:1比例條件，一份與溶劑混合后加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0，室溫中磁力攪拌3h考察慶大霉素C1a結晶情況；一份加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0后與溶劑混合，室溫中磁力攪拌3h考察慶大霉素C1a結晶情況。如有固體析出，送HPLC檢測其純度。

(3)有機溶劑混合比例的優(yōu)化：選用“(1)”較優(yōu)的兩種溶劑，按照甲醇:乙醇 1:1、1:2、2:1、1:4、4:1的比例混合，分別與10mL含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液以7:1的比例混合均勻，加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0后于室溫中磁力攪拌3h考察慶大霉素C1a結晶情況。如有固體析出，送HPLC檢測其純度和收率。

(4)結晶溫度及結晶體系pH值的優(yōu)化：按照“(3)”中較優(yōu)溶劑條件分別與5組10mL含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液混合后調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0分別在30℃、室溫、10℃、0℃、-10℃下磁力攪拌3h考察慶大霉素C1a結晶情況。如有固體析出，送HPLC檢測其純度。

按照“(3)”中較優(yōu)溶劑條件分別與3組10mL含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液混合后室溫下，按照其硫酸與慶大霉素C1a的摩爾的量比為2:1、3:1、4:1加入混合液，磁力攪拌3h考察慶大霉素C1a結晶情況。如有固體析出，送HPLC檢測其純度。

(5)考察不同酸對其結晶形態(tài)及純度影響：按照“(4)”中較優(yōu)的結晶條件，分別與3組含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液按照7:1混合室溫加酸結晶，分別考察甲酸、乙酸、磷酸、鹽酸和碳酸(通CO2氣體)，按照物質(zhì)的量摩爾比2:1的比例加入即分別加0.56、0.50、0.58和0.75mL到混合溶液中，磁力攪拌3h考察慶大霉素C1a結晶情況。如有固體析出，送HPLC檢測其純度。其中結晶狀態(tài)較好的檢測其電子掃描顯微鏡形態(tài)和X射線粉末晶體衍射。

(6)電子掃描顯微鏡形態(tài)觀察和X射線粉末晶體衍射檢測方法：電子掃描顯微鏡形態(tài)觀察條件為：使用導電膠，將樣品粉末均勻黏附在銅臺上。除去多余粉末，對樣品濺射噴金30s后，用掃描電鏡進行觀察。X射線粉末晶體衍射的測定條件為：CuKa 40kV 40mA為光源，步長0.02°，掃描速度：8°/min，掃描范圍：3°～80°，室溫。

1.2.4 大孔吸附樹脂和鹽析結晶工藝組合優(yōu)化

由于最終需要獲得慶大霉素C1a游離堿形態(tài)，而上述純化過程均會引入無機鹽，因此在上述精制過程后需要一步離子交換樹脂柱層析除鹽過程；最終通過減壓真空濃縮除氨水，并冷凍干燥即可獲得高純度慶大霉素C1a游離堿凍干粉。

所以最終的工藝路線組合可以有路線A和路線B，詳見圖1，分別進行上述實驗后比較兩種路線純化后獲得慶大霉素C1a游離堿凍干粉的純度及純化過程的總收率。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂柱層析

2.1.1 色譜型大孔吸附樹脂的初篩(圖2)

圖1 組合優(yōu)化的兩種工藝路線Fig.1 Combinatorial optimization of two routes

根據(jù)前期依替米星純化經(jīng)驗[8]，4種色譜型大孔吸附樹脂HZ-色譜填料50、色譜3號、NM100和NM200均能吸附慶大霉素C1a游離堿，水洗去除水溶強極性雜質(zhì)后，pH1.6稀硫酸洗脫后，能去除主要雜質(zhì)西索米星和小諾霉素。4種樹脂純化后HPLC純度96%以上慶大霉素C1a的收率只有50%～60%，損失較大；其中NM200樹脂純化效果最佳。

2.1.2 NM200大孔吸附樹脂柱層析參數(shù)的優(yōu)化

圖2 色譜型大孔吸附樹脂初篩Fig.2 Chromatographic macroporous adsorption resin screening

(1)解析pH值的優(yōu)化(圖3)：選取“2.1.1”項中最優(yōu)樹脂NM200進行解析pH的優(yōu)化，pH1.6條件下解析較快，分離度不佳，造成HPLC純度96%以上慶大霉素C1a的收率都低于60%。適當提高pH后，pH2.0和pH 2.2解析條件下，收率大于70%。但pH2.2解析時間較長，且與pH2.0相比，無顯著差異。因此，選取pH 2.0作為較優(yōu)的解析條件。

(2)解吸流速的優(yōu)化：選取“(1)”最優(yōu)解析pH2.0進行解析流速的考察，其中流速1.0和1.5BV/h的收率差異不大；最佳流速為0.5BV/h，HPLC純度96%以上慶大霉素C1a的收率達到76%。由圖4可知，最優(yōu)解析流速為0.5BV/h。

2.2 鹽析結晶法精制慶大霉素C1a

2.2.1 有機溶劑的種類和比例的初篩(表3)

圖3 NM200樹脂解析pH值優(yōu)化Fig.3 Optimization of NM200 resin elution pH value

圖4 NM200樹脂解析流速的優(yōu)化Fig.4 Optimization of NM200 resin elution flow rate

表3 有機溶劑的種類及與水溶液比例初篩Tab.3 Type and mixing ratio of organic solvent with aqueous solution

由于慶大霉素C1a水溶性極強，因此選取四種強極性有機溶劑甲醇、乙醇、丙酮和異丙醇進行鹽析結晶不良溶劑的篩選。如表3所示，只有甲醇和乙醇與含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液7:1和10:1互溶時能產(chǎn)生白色固體，其余條件都是油狀物。將上述獲得的白色固體過濾烘干后送HPLC檢測慶大霉素C1a純度分別為97.1%、97.3%、97.3%和97.0%，說明鹽析結晶過程能大幅度提高慶大霉素C1a純度。

2.2.2 加入硫酸調(diào)節(jié)pH先后順序的考察

由于慶大霉素C1a不同pH值條件下極性變化很大，因此pH值調(diào)節(jié)順序是影響結晶狀態(tài)的重要因素之一。通過比較加入硫酸調(diào)節(jié)pH值的順序差異發(fā)現(xiàn)，預先調(diào)pH后加7:1甲醇時，產(chǎn)生的白色固體形成大的絮狀物，析出狀態(tài)較差；而先加7:1甲醇后調(diào)pH值時，產(chǎn)生的白色固體形成分散小顆粒狀固體，析出狀態(tài)較好。將上述獲得的白色固體過濾烘干后送HPLC檢測慶大霉素C1a純度分別為97.1%和97.5%。從析出狀態(tài)和析出固體純度指標看，先加入不良溶劑后加入硫酸調(diào)pH值的條件更佳。

2.2.3 有機溶劑混合比例的優(yōu)化

根據(jù)其他氨糖類鹽析結晶的經(jīng)驗[8-9]，多種不良溶劑的混合結晶比例會對結晶純度和收率產(chǎn)生一定的影響。分別按照兩種不良溶劑甲醇與乙醇1:1、1:2、2:1、1:4、4:1的比例混合，并以7:1比例與含慶大霉素C1a粗品300mg/mL的水溶液混合鹽析結晶，結果如表4所示。其中甲醇與乙醇1:2條件與單一溶劑甲醇和乙醇相比，慶大霉素C1a提高了0.8%左右；純化收率都在93%以上。

2.2.4 結晶溫度及結晶體系pH值的優(yōu)化

考察結晶溫度時，在30℃、室溫、10℃時其有結晶狀態(tài)較好，獲得固體的慶大霉素C1a純度分別為97.9%、98.1%和97.5%。而在0℃及-10℃時，其結晶狀態(tài)較差，獲得固體的慶大霉素C1a純度分別為97.7%、97.3%。結果顯示，室溫時結晶狀態(tài)較好，獲得的慶大霉素C1a純度最高。

考察結晶體系pH值時，按照硫酸和慶大霉素C1a摩爾比2:1(pH6.5左右)、3:1、4:1增加硫酸添加量后，獲得的慶大霉素C1a純度依次為98.0%，97.7%，97.8%。結果說明硫酸添加量對結晶純度影響較小。

表4 甲醇和乙醇混合比例對析出慶大霉素C1a純度和收率的影響Tab.4 Effect of mixing ratio of methanol and ethanol on the purity and yield of Gentamicin C1a

2.2.5 考察不同酸對其結晶形態(tài)及純度影響(圖5)

除硫酸外，其余幾種無機酸也可能與慶大霉素C1a鹽析產(chǎn)生較好的結晶物?？疾炝思姿帷⒁宜帷Ⅺ}酸、磷酸和碳酸(通CO2氣體)，其中甲酸、乙酸和鹽酸不析出固體，無法產(chǎn)生晶體。而磷酸和碳酸及上述主要研究的硫酸都能析出白色固體，但PXRD和電鏡照片顯示其結晶有序性較差，不是多晶型狀態(tài)。磷酸和碳酸析晶固體的慶大霉素C1a純度分別為95.2%和96.6%。

圖5 磷酸、碳酸和硫酸鹽析固體掃描電鏡照品和PXRD圖譜Fig.5 Phosphoric acid,carbonic acid and sulfate gentamicin C1a solid scanning electron microscopy and PXRD map

2.3 大孔吸附樹脂和鹽析結晶工藝組合優(yōu)化

按照路線A和路線B進行兩種路線組合優(yōu)化(表5)，比較大孔吸附樹脂柱層析和鹽析結晶工序順序?qū)ψ罱K產(chǎn)品純度和純化收率的影響。

結果顯示(圖6)，路線B 獲得的樣品純度為99.5%，收率大于70%；具有很強的產(chǎn)業(yè)化潛力。主要成本在樹脂工序的高純度樣品損失和樹脂的一次性投入。

3 結論

為了制備高純度慶大霉素C1a游離堿，本論文摸索了大孔吸附樹脂法和鹽析溶媒析晶法來進一步純化HPLC純度為91%～93%的慶大霉素C1a游離堿粗品。

表5 路線A和路線B每個工序樣品純度和純化收率Tab.5 Route A and route B purity and purification yield of each process sample

(1)通過篩選色譜型大孔吸附樹脂，獲得較優(yōu)的樹脂NM200；優(yōu)化了影響層析收率的主要影響因素解析液pH值和解析流速，獲得較優(yōu)的解析液pH值為2.0和流速0.5BV/h。經(jīng)過優(yōu)化后，純化收率從65%提高至74%。

圖6 慶大霉素C1a樣品的HPLC-ELSD純度檢測圖譜Fig.6 HPLC-ELSD purity detection map of gentamicin C1a sample

(2)通過篩選有機溶劑的種類和比例，確定較優(yōu)的不良溶劑為甲醇和乙醇；比較硫酸添加順序、甲醇和乙醇混合比例，確定先加溶劑后加硫酸和甲醇與乙醇1:2的條件較優(yōu)，優(yōu)化后獲得的慶大霉素C1a純度達到98.2%，收率大于93%。進一步優(yōu)化結晶溫度和結晶體系pH值，發(fā)現(xiàn)室溫條件下硫酸和慶大霉素C1a摩爾比2:1(pH6.5左右)條件較優(yōu)。

(3)研究了多種無機酸鹽析結晶的情況，發(fā)現(xiàn)磷酸、硫酸和碳酸條件下能析出白色固體。但電子掃描電鏡和PXRD結果顯示，結晶狀態(tài)較差，未達到多晶型狀態(tài)。

(4)通過比較大孔吸附樹脂和鹽析結晶的純化順序變化，組合純化后獲得的慶大霉素C1a游離堿純度大于99.0%，比純化前樣品提高6%以上，收率大于70%。