鄭業(yè)煥 李軼 金湘東 荊鵬偉

(1 鄭州安圖生物工程股份有限公司，鄭州 450016；2 河南省人民醫(yī)院，鄭州 450003；3 鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450052；4 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450008)

腸桿菌科細(xì)菌是革蘭陰性菌中非常重要的一類微生物，是引起臨床感染的重要病原菌之一，可致化膿性疾病、肺炎、腦膜炎、菌血癥以及傷口、泌尿道和腸道的感染[1-2]。多黏菌素是從多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)培養(yǎng)液中獲得的多肽類抗生素，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)共分為5型，其中僅B和E應(yīng)用于臨床，主要用于治療革蘭陰性菌所致的全身多位點(diǎn)感染，因其較嚴(yán)重的腎毒性及神經(jīng)系統(tǒng)毒性曾經(jīng)一度被棄用。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，多黏菌素類作為治療的最后選擇又被應(yīng)用于臨床[3-4]。本研究結(jié)合最新2018版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會(huì)(CLSI)M100-S28標(biāo)準(zhǔn)[5]，收集了2018年上半年河南省人民醫(yī)院、河南省中醫(yī)一附院、鄭州大學(xué)二附院臨床分離腸桿科菌株887株，同時(shí)采用E-test法和微量稀釋法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，考察兩種方法的一致性，為臨床腸桿菌科細(xì)菌體外多黏菌素藥敏試驗(yàn)提供參考，指導(dǎo)臨床合理進(jìn)行體外藥敏檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

本研究收集了2018年1月—6月河南省人民醫(yī)院、河南省中醫(yī)第一附屬醫(yī)院、鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床常規(guī)分離腸桿科菌株887份，其中埃希菌屬331株，克雷伯菌屬207株，沙門菌屬103株，志賀菌屬112株，其他屬腸桿菌134株(腸桿菌屬57株，檸檬酸桿菌屬48株，耶爾森菌屬13株，摩根菌屬7株，布丘菌屬6株，西地西菌屬3株)。質(zhì)控菌株采用ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌(ATCC25922)、產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC700324)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、肺炎克雷伯菌肺炎亞種(ATCC13883)、腸炎沙門菌(ATCC13076)、鼠傷沙門菌(ATCC14028)、索氏志賀菌(ATCC25931)、霍氏腸桿菌(ATCC700323)、人蒼白桿菌(ATCC49687)、人蒼白桿菌(ATCCBAA-749)均源于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 試劑

多黏菌素B藥敏條由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，血瓊脂平板、90mm Mueller-Hinton(MH)平板均由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供。多黏菌素B抗菌藥物為標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國食品藥品檢定研究院；MH肉湯購自于BD醫(yī)療器械(上海)有限公司。

1.3 方法

按照多黏菌素B藥敏條說明書進(jìn)行操作。待測菌株和質(zhì)控菌株分純過夜，挑取純菌落制備濁度為1.5×108CFU/mL濃度菌液，用無菌棉簽浸蘸菌液涂布于90mm MH平板表面，放置5min后，用真空吸筆吸取藥敏條放置于平板上然后放置(35±1)℃孵育，孵育16～20h后，讀取抑菌圈邊緣與藥敏條相交位置處的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值。微量稀釋法的操作和判讀參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)：在96孔酶標(biāo)板的2～12孔各加100μL肉湯培養(yǎng)基；加100μL含64μg/mL抗生素的肉湯培養(yǎng)基至第1和第2孔中；從第2～12孔作對(duì)倍稀釋；加100μL含有105CFU待檢細(xì)菌新鮮肉湯培養(yǎng)基于每一孔；設(shè)立陽性對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔，抗生素對(duì)照孔；密封酶標(biāo)板，(35±1)℃環(huán)境下孵育20～24h，當(dāng)陽性對(duì)照孔明顯渾濁時(shí)，記錄MIC值。EA(essential agreement)：指待測方法與對(duì)比方法(或參考方法)MIC值在±1個(gè)稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)的一致性[5-7]。藥敏條與微量稀釋法比對(duì)超過±1個(gè)稀釋倍數(shù)時(shí)進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測仍然超過±1個(gè)稀釋倍數(shù)判為不一致[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＞0.05為無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控菌株檢測結(jié)果

本次質(zhì)控選用的9株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，均重復(fù)3次檢測，其中僅大腸埃希菌ATCC25922在CLSI有質(zhì)控范圍為0.5～2μg/mL，采用微量稀釋法和藥敏測定MIC值均在±1個(gè)稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，符合性能要求，具體數(shù)據(jù)見表1所示。

2.2 樣本結(jié)果分析

共計(jì)887株腸桿菌的比對(duì)中，873株用藥敏條和微量稀釋法測定MIC值在±1個(gè)稀釋倍數(shù)的范圍內(nèi)。其中完全一致的有594株(594/887,66.97%)，±0.5個(gè)稀釋倍數(shù)的有170株(170/887,19.17%)，±1個(gè)稀釋倍數(shù)的有86株(86/887,9.70%)。有45株菌的MIC值超出了±1個(gè)稀釋倍數(shù)，EA%為94.93%(842/887)，針對(duì)第一次測定不符合的經(jīng)復(fù)測確認(rèn)，有36株菌測定結(jié)果仍然不符合，即糾正后的EA%為95.94%(851/887)，結(jié)果見表2所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)菌株重復(fù)3次檢測結(jié)果Tab.1 Test results for standard strains repeated three times

2.3 不一致結(jié)果分析

兩種方法MIC值超過|±1|個(gè)稀釋倍數(shù)的36株，測定MIC值見表3所示，相關(guān)性分析：P=0.012＜0.05，說明藥敏條檢測結(jié)果與微量稀釋法檢測結(jié)果具有顯著的線性相關(guān)。配對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果中的P＞0.05，說明兩者結(jié)果差異不明顯。

表2 兩種方法所測MIC值EA結(jié)果Tab.2 EA results of MIC values measured by two methods

2.4 不同類間分析

針對(duì)887株腸桿菌科細(xì)菌按照不同種屬分類，計(jì)算其EA一致性，埃希菌屬的EA為95.77%(317/331)，克雷伯菌屬的EA為96.14%(199/207)，沙門菌屬的EA為97.09%(100/103)，志賀菌屬的EA為96.43%(108/ 112)，其他屬腸桿菌的EA為94.03%(126/134)，并對(duì)這5種進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果見表4所示。

3 討論

目前，體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)技術(shù)主要包括紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法、商品化全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(如Vitek-Compact,BD Phoenix)和E-test法等。其中，紙片擴(kuò)散法操作簡單、對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較低，且花費(fèi)較低，適合臨床實(shí)驗(yàn)室尤其是基層醫(yī)院使用[8-9]。微量肉湯稀釋法是美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的參考方法，但該方法操作繁瑣，暫無全自動(dòng)系統(tǒng)出現(xiàn)，并且板卡抗菌劑種類固定，影響臨床推廣使用。商品化全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)使用方便，但價(jià)格較昂貴且需要特殊儀器設(shè)備、抗菌藥物選擇相對(duì)固定、測定濃度范圍較窄[10]，故在常規(guī)應(yīng)用中存在一定局限性。E-test法則綜合了MIC法與紙片擴(kuò)散法的優(yōu)點(diǎn)，操作簡單、可得到具體的MIC值、測定濃度范圍寬、可選擇的藥物較多等，近些年來逐漸受到了實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可。然而多黏菌素在瓊脂中不易擴(kuò)散導(dǎo)致該方法可靠性降低[3]，2018版CLSI M100-S28中針對(duì)黏菌素(多黏菌素B)藥敏體外檢測新增備注說明，針對(duì)銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌建議采用的微量肉湯稀釋法，刪除紙片擴(kuò)散法和E-test法折點(diǎn)范圍，備注說明，不建議采用紙片擴(kuò)散法和E-test法藥敏條。本研究參考指南，采用ATCC標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行平行體外藥敏試驗(yàn)，ATCC菌株確保檢測的可溯源性，質(zhì)控菌株檢測結(jié)果均一致，即E符合率為100%，說明了試驗(yàn)結(jié)果的有效性。

表3 超過|±1|個(gè)稀釋倍數(shù)36株臨床菌株檢測MIC值Tab.3 The MIC outside |±1| dilution ration of 36 clinical strains

表4 腸桿菌科不同屬檢測EA一致性分析Tab.4 EA consistency analysis of different genus of Enterobacteriaceae

本研究對(duì)887株腸桿菌科細(xì)菌，分別采用微量肉湯稀釋法、E-test法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，測定抗菌藥物的MIC，并統(tǒng)計(jì)分析兩種方法檢測MIC的一致性。共計(jì)887株腸桿菌的比對(duì)中，有45株菌的MIC值超出了|±1|個(gè)稀釋倍數(shù)，經(jīng)復(fù)測確認(rèn)，有36株菌測定結(jié)果仍然不符合，即糾正后的EA%為95.94%(851/887)。統(tǒng)計(jì)學(xué)χ2方檢驗(yàn)，采用P＞0.05，二者無顯著性差異，針對(duì)復(fù)測后36株菌株的一致性超過±1個(gè)稀釋倍數(shù)，推測可能是方法學(xué)或菌株的差異所致，也可能與藥敏檢測所用MH培養(yǎng)基的pH值、組分差異有關(guān)[3]。針對(duì)887株腸桿菌科細(xì)菌按照不同種屬分成5類進(jìn)行分析，EA值最高的為沙門菌屬的97.09%(100/103)，EA最低的為其他屬腸桿菌的94.03%(126/134)，并對(duì)這5種進(jìn)行顯著性差異分析，P=0.801＞0.05，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)[11]中對(duì)藥敏檢測試劑性能評(píng)價(jià)要求與微量肉湯稀釋法比對(duì)大于90%，該研究中比對(duì)一致性均高于94%，說明腸桿菌科細(xì)菌使用E-test法藥敏條試劑是性能滿足預(yù)期要求。針對(duì)36株臨床菌檢測MIC值，相關(guān)性分析：P=0.012＜0.05，說明藥敏條檢測結(jié)果與微量稀釋法檢測結(jié)果具有顯著的線性相關(guān)，配對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果中的P＞0.05，說明兩者結(jié)果差異不明顯。

體外藥敏試驗(yàn)是臨床選擇抗菌藥物治療的重要參考依據(jù)，準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)對(duì)臨床極為重要。目前全世界關(guān)于多黏菌素的E-test法耐藥值折點(diǎn)問題仍無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，而多黏菌素將越來越廣泛地應(yīng)用于臨床多重耐藥革蘭陰性菌感染的治療。在本研究中，多黏菌素B藥敏條用于腸桿菌科檢測時(shí)，E-test法和微量稀釋法具有很高的一致性，說明E-test法多黏菌素藥敏條可用于臨床腸桿菌科體外藥敏檢測。