柴紅梅，張小雷，趙永昌，蘇開美，陳衛(wèi)民

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650205）

假單胞菌屬細(xì)菌是主要的食用菌病菌，能引起平菇 （Pleurotus ostreatus）、雙孢菇 （Agaricus bisporus）、香菇 （Lentinula edodes）、金針菇 （Flammulina velutipes）等的褐斑病[1-4]，其繁殖速度快、傳播范圍較廣，容易給食用菌栽培場造成極大的損失。因此，及時鑒別危害病菌的種類和特征、較早預(yù)防，可以有效減輕病菌危害。

在食用菌栽培生產(chǎn)中，目前已知的最為普遍的細(xì)菌性病原菌為托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasiiPaine），它能通過產(chǎn)生一種脂多糖類的細(xì)胞外毒素tolaasins，有效地破壞食用菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞破裂[5-6]，受感染的子實體表面發(fā)粘腐爛并發(fā)生褐變。托拉斯假單胞桿菌能侵染多種栽培食用菌，其傳播介體為空氣、土壤、帶病子實體、昆蟲等，能夠在較短時間內(nèi)感染子實體、產(chǎn)生病斑并快速蔓延。除了托拉斯假單胞桿菌，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[7]、銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）[8]、洋蔥假單胞菌 （Pseudomonas cepaica）[9]、施氏假單胞菌 （Pseudomonas stutzeri）[10]及綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）[11]等也都會對不同的食用菌造成比較大的危害。從平菇和雙孢菇中分離到了托拉斯假單胞菌、熒光假單胞菌和Pseudomonas gingeri[12-13]。另外，在河南的杏鮑菇子實體中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性病害，表現(xiàn)為子實體畸形，菌肉呈水漬狀，并逐步腐爛，但沒有鑒定出該病原菌的種類[14]。

盡管已有多種方法被用來進(jìn)行假單胞病原菌的殺滅，包括噴灑二氧化氯、次氯酸鈣及鏈霉素等，但病變發(fā)生后很難徹底控制病原菌，因此提前檢測菇房環(huán)境并進(jìn)行阻斷，更有利于后期的生產(chǎn)開展。統(tǒng)計病原菌種類，掌握其生物學(xué)特征，特別是DNA序列，可以有效的進(jìn)行類別鑒定。本研究從云南陸良平菇及杏鮑菇種植場分離獲得了2株假單胞桿菌菌株，分離純化后，擴(kuò)增其16S rDNA片段，進(jìn)行序列分析和分類地位分析，為假單胞病原菌在分子水平的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從云南陸良種植場采集感染病菌的平菇（P.ostreatus）和杏鮑菇（P.eryngii）子實體，分別挑取一個染病部位的菌斑置于無菌水中，吸取菌液涂布到酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基（蛋白胨0.2%、酵母粉0.2%、葡萄糖2%、瓊脂粉1.5%，pH自然） 固體平板，培養(yǎng)獲得單菌落，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增及序列測定

用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物對16SF（5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’） 和 16SR（5’-TACG GTTACCTTGTTACGACTT-3’） 擴(kuò)增菌株的16S rDNA片段。平菇和杏鮑菇樣品所分離的2株病原菌落中，都分別隨機(jī)挑選3個菌落，進(jìn)行菌落PCR。反應(yīng)體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL（天根生化科技有限公司），10 μmol·L-1引物各2 μL，DNA模板1 μL，無菌去離子水補足50 μL。擴(kuò)增在BIO-RAD公司的C1000TM Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，程序如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 1 min 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對符合預(yù)測大小的片段膠回收后進(jìn)行測序。本試驗所用引物的合成及PCR產(chǎn)物序列測定均在昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 序列特征及聚類分析

采用DNAStar軟件包SeqMan程序?qū)λ?6S rDNA序列進(jìn)行拼接，并提交GenBank進(jìn)行Blast搜索，從而獲得近緣種的相似序列。采用ClustalX程序比對拼接序列，去除兩端長短不一和模糊的部分，使序列長度基本一致。采用Mega 4軟件中的鄰接法（Neighbor JoiningAnalysis，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在分析過程中，將Alignment序列中出現(xiàn)的空缺視為信息丟失。采用自舉法進(jìn)行分支支持率分析，設(shè)1000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌侵染子實體特征

在云南陸良種植場出現(xiàn)了大面積的平菇和杏鮑菇病害，從圖1可以看出，平菇顯現(xiàn)出褐腐病特征，受感染子實體表面發(fā)粘，出現(xiàn)淡乳白色菌落，然后子實體發(fā)軟萎縮，并且發(fā)生褐變；杏鮑菇子實體發(fā)病時表面先出現(xiàn)水漬狀的斑點，從里到外腐爛并滲出淡褐色液體，之后整個子實體完全消解。另外，該病原感染初期還能造成原基的發(fā)育畸形。

圖1 病原菌株P(guān)seudomonas sp.造成的平菇（A） 和杏鮑菇（B） 病害Fig.1 Diseases of Pleurotus ostreatus(A)and Pleurotus eryngii(B)caused by Pseudomonas sp.

2.2 病原菌的分離及分子鑒定

所采集的病原菌經(jīng)稀釋、平板涂布后挑取單菌落。從平菇和杏鮑菇所獲病原菌菌落中，各隨機(jī)選擇3個菌落進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

圖2 病原菌株P(guān)seudomonas sp.的16S rDNA核酸序列Fig.2 16S rDNA sequences of Pseudomonas sp.

使用特異性引物16S F/R，每個菌株擴(kuò)增獲得1個特異性片段，膠回收后進(jìn)行測序。片段含有800多個堿基，去除兩端模糊序列后，序列長度為734 bp（圖2）。Clustal X比對發(fā)現(xiàn)，從平菇及杏鮑菇分離到的病原菌菌株的16S rDNA序列完全一致，表明它們?yōu)橥粋€種。序列提交GeneBank blastn分析顯示，與假單胞屬各近似物種的相似度從99.26%到99.56%。根據(jù)16S rDNA分析，可確定所獲病原菌為假單胞菌屬，但不能確定具體種。

2.3 病原菌株的系統(tǒng)分析

所分離病原菌Pseudomonassp.與同屬近緣種的16S rDNA序列作聚類分析（圖3），結(jié)果顯示其與P.gessardii、P.fluorescens、P.reactans、P.azotoformans等物種能更好的聚在一起，而與常見的P.tolaasii親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 Pseudomonas 16S rDNA系統(tǒng)聚類圖Fig.3 Phylogeny of Pseudomonas based on 16S rDNA

3 結(jié)論

假單胞菌屬多種菌為食用菌的主要細(xì)菌性病原菌，這些病原菌具有傳播范圍廣、發(fā)病速度快等特點，給栽培場帶來極大的危害?？焖勹b定病原菌種類并提前預(yù)防可以有效減輕危害帶來的損失，而利用核酸序列進(jìn)行分析是一個快捷鑒定病原菌的途徑。16S rDNA核酸片段測定已經(jīng)被廣泛用于細(xì)菌物種鑒定，因此本研究使用該方法來對病原菌株進(jìn)行鑒定。此外，由于細(xì)菌通過形態(tài)難以進(jìn)行區(qū)分，還需要后續(xù)的生理生化試驗進(jìn)行深入研究。

本研究中從平菇和杏鮑菇感染子實體中分離了假單胞病原菌株P(guān)seudomonassp.，其16S rDNA序列與其他假單胞菌屬真菌相似性最高為99.56%，而聚類結(jié)果表明，它與P.gessardii、P.fluorescens、P.reactans、P.azotoformans等物種的親緣性大于P.tolaasii。目前并不能確定這個菌株為假單胞屬的哪一個種，其具體的分類地位仍需后續(xù)的生理生化試驗進(jìn)行證實。

根據(jù)序列分析結(jié)果，本研究中所獲得的菌株異于常見的托拉斯假單胞菌，而且該菌能侵染平菇及杏鮑菇，說明其寄主具有廣泛性。以前的研究極少有杏鮑菇病原菌相關(guān)報道，在此次的研究中，發(fā)現(xiàn)并鑒定了假單胞菌相關(guān)種侵染杏鮑菇并造成病害的相關(guān)特征，為杏鮑菇的種植及病害防治提供了有用的信息。至于其它地區(qū)關(guān)于杏鮑菇病害特征的描述，由于缺乏核酸信息等方面的證據(jù)，不能判斷是否為假單胞菌屬相關(guān)物種所造成[14]，需要進(jìn)一步予以證實。這是從杏鮑菇分離到假單胞菌為數(shù)不多的相關(guān)研究之一，給相關(guān)病原菌的鑒定及防治提供了有效支撐，同時也為食用菌細(xì)菌性病害研究提供了重要的信息。

此外，根據(jù)該病原菌與同屬其它種的16S rDNA序列相似度比對來看，假單胞菌作為食用菌的主要病害，其各個種極為相似，因而需要結(jié)合生理生化特征對該屬物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，并明確各個種的寄主和造成病害的特征，以便為病害的鑒定及防治提供指導(dǎo)，減輕病原菌給食用菌種植帶來的危害。