劉麗麗,王曉雯,朱建亞,張 蓉,朱 華,田照輝
( 北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所,漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100068 )
熱激蛋白(HSP)是一類在不同生命形式間高度保守的蛋白質(zhì)[1],能夠抵御環(huán)境壓力、促進(jìn)細(xì)胞生長[2]。熱激蛋白家族根據(jù)蛋白序列同源性和分子質(zhì)量,可以分為HSP40、HSP70、HSP90、HSP100和HSP110等,其中HSP70蛋白主要以胞內(nèi)分子伴侶的形式參與蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運(yùn),在細(xì)胞生長、存活和凋亡過程發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。部分Hsp70基因沒有內(nèi)含子,這使得開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄就可產(chǎn)生成熟的mRNA以適應(yīng)Hsp70基因大量快速表達(dá)的需要,阻止應(yīng)激源對(duì)其mRNA前體的影響[5],這促進(jìn)了HSP70蛋白作為環(huán)境脅迫分子標(biāo)志物的研究。在溫度刺激、重金屬脅迫、自由基攻擊和微生物感染等環(huán)境下,HSP70蛋白能夠迅速并準(zhǔn)確響應(yīng),因此作為響應(yīng)外界環(huán)境刺激的生物標(biāo)志物得到深入研究[3]。
魚類屬于變溫動(dòng)物,極易受溫度等環(huán)境影響,HSP蛋白在魚類應(yīng)對(duì)溫度變化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。虎皮魚(Puntiustetrazona)原產(chǎn)于印度尼西亞的蘇門答臘島、加里曼丹島和馬來西亞的內(nèi)陸水域,體型為典型的紡錘形,側(cè)扁,長5~7 cm。體表淺黃色,上覆四條垂直的濃黑色條紋,似虎紋,故名虎皮魚。虎皮魚吻部和各鰭呈紅色,相映成趣,群游,性情活潑、行動(dòng)敏捷,是廣受市場(chǎng)歡迎的小型熱帶魚?;⑵~是狹溫?zé)釒~類,對(duì)溫度變化十分敏感,適宜水溫為23~28 ℃,溫度降低則影響其繁殖、攝食和生存。HSP70蛋白是魚類中研究廣泛的一類熱激蛋白。目前已從廣溫魚類草魚(Ctenopharyngodonidella)[3]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[7]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[8]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[9]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[10]、達(dá)氏鰉(Husodauricus)[11]等,冷水魚類施氏鱘(Acipenserschrenckii)[12]、銀海鯛(Sparussarba)[13]等和少數(shù)熱帶魚類斑馬魚(Daniorerio)[14]、黃雀鯛(Pomacentrusmoluccensis)等擴(kuò)增到Hsp70基因的cDNA序列,但是Hsp70基因在虎皮魚體內(nèi)的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)機(jī)制尚未見報(bào)道。
在前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn),虎皮魚Hsp70(PtHsp70)基因mRNA水平可能受到低溫脅迫的影響(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。為此,筆者克隆PtHsp70基因cDNA的完整編碼序列,分析序列同源性,預(yù)測(cè)其編碼氨基酸序列結(jié)構(gòu),通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)分析PtHsp70基因在不同組織中的特異性表達(dá),分析低溫脅迫下PtHsp70基因表達(dá)水平的變化,探明PtHsp70基因在成年虎皮魚體內(nèi)存在的表達(dá)特征。
試驗(yàn)用虎皮魚購自虎皮魚漁場(chǎng)(山東棗莊),在本實(shí)驗(yàn)室完成馴化,并長期養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件為:水溫25~27 ℃,pH 6.5~7.4,kH 6~7,24 h不間斷通氧,水體循環(huán)過濾,每日喂食商品干飼料2次。
挑選體型大小相近、健康活潑的8月齡虎皮魚150尾,用于梯度低溫脅迫試驗(yàn)。將150尾虎皮魚隨機(jī)分為5個(gè)養(yǎng)殖缸,每個(gè)養(yǎng)殖缸30 L,含有30尾虎皮魚。試驗(yàn)第1 d水溫保持為27 ℃,次日起每24 h降低溫度如下:△T1=4 ℃/d,△T2=4 ℃/d,△T3=4 ℃/d,△T4=2 ℃/d,其他條件維持不變。直至水溫降至13 ℃,繼續(xù)處理24 h,結(jié)束低溫脅迫試驗(yàn)。每個(gè)溫度處理結(jié)束后,每缸隨機(jī)取3尾虎皮魚,立即解剖用于總RNA提取,試驗(yàn)共5個(gè)生物學(xué)平行。
分別對(duì)27、23、19、15、13 ℃處理24 h后的虎皮魚提取總RNA。間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉后,解剖分別取其腦、鰓、肝臟和肌肉組織,同種組織混合存放,立即使用RNAiso Plus(TaKaRa公司,D9108A)試劑提取總RNA,操作按照試劑說明書進(jìn)行。Nanodrop2000核酸蛋白濃度檢測(cè)儀測(cè)定總RNA含量和污染情況,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
以各組織總RNA為模板,采用1st strand cDNA合成試劑盒(TaKaRa公司,6110A)合成cDNA第一鏈,操作方法按照試劑說明書進(jìn)行。Nanodrop2000核酸蛋白濃度檢測(cè)儀測(cè)定cDNA合成產(chǎn)物濃度,-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中報(bào)道的魚類Hsp70基因cDNA保守序列,設(shè)計(jì)引物HSP70CDS-F和HSP70CDS-R(表1),Ex Taq酶(TaKaRa公司,DRR001A)PCR擴(kuò)增獲得PtHsp70基因cDNA部分序列。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后送交擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。
基于得到的PtHsp70基因cDNA部分保守序列,Primer3Web(http:∥primer3.ut.ee/)在線設(shè)計(jì)引物HSP70-GSP1和HSP70-GSP2,用于5′RACE和3′RACE。采用SMARTer RACE 5′/3′ Kit(Clontech,634858)試劑盒,按照說明書配制反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別克隆得到PtHsp70基因cDNA的5′和3′ RACE產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定,凝膠DNA回收試劑盒(TaKaRa公司,9762)回收目的條帶DNA,送交擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序,采用SeqMan軟件對(duì)測(cè)序片段與得到的PtHsp70基因cDNA部分保守序列進(jìn)行拼接。
拼接序列經(jīng)Blastn在線(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì),結(jié)果表明該序列與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫公布的Hsp70基因mRNA序列具有高度同源性;使用Clustal X 2和DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì),ORF Finder在線(http:∥www.expasy.ch/tools/)預(yù)測(cè)開放閱讀框和編碼氨基酸序列。BLASTP在線(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析(數(shù)據(jù)庫:CDSEARCH/cdd v3.16 ,2018年4月26日)。
以本研究中獲得的腦、鰓、肝臟和肌肉組織cDNA為模板,根據(jù)獲得的PtHsp70基因cDNA序列,Primer3Web(http:∥primer3.ut.ee/)在線設(shè)計(jì)引物HSP70-qF和HSP70-qR用于熒光定量PCR(表1)。熒光定量PCR試驗(yàn)以虎皮魚Gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因,使用天根熒光定量PCR試劑盒(FP209),ABI StepOne Plus儀器收集熒光信號(hào)。
本研究克隆到的序列經(jīng)過測(cè)序、拼接和序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)與斑馬魚、鯉魚、鯽魚(Carassiusauratus)、光唇魚(Acrossocheilusfasciatus)和齊口裂腹魚Hsp70基因cDNA全序列的相似度分別為94%、91%、91%、91%和90%,確認(rèn)該序列為PtHsp70基因cDNA序列(表2)。全長2317 bp,其中5′非編碼區(qū)長120 bp,3′非編碼區(qū)長266 bp,編碼區(qū)長1932 bp,對(duì)應(yīng)的開放閱讀框?yàn)?21~2052 bp,編碼643個(gè)氨基酸。
表1 本研究所用引物信息表
表2 PtHsp70基因cDNA序列BLAST比對(duì)結(jié)果
將PtHsp70基因編碼區(qū)與鯉魚、鯽魚、斑馬魚Hsp70基因編碼區(qū)序列進(jìn)行多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)其序列相似性為95.43%(圖1),表明PtHsp70基因編碼序列高度保守。
研究預(yù)測(cè)PtHsp70基因cDNA序列共翻譯643個(gè)氨基酸,其中親水性氨基酸215個(gè),疏水性氨基酸161個(gè),虎皮魚HSP蛋白分子量為70.54975 ku,等電點(diǎn)為5.375(圖2)。SMART分析顯示,虎皮魚HSP蛋白氨基酸序列含有典型的蛋白結(jié)構(gòu)域coiled coil(514~536 aa)。
虎皮魚HSP70蛋白的氨基酸序列包含典型的熱激蛋白保守結(jié)構(gòu)域,例如核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)、BAG/HSP70結(jié)合位點(diǎn)、NEF/HSP70結(jié)合位點(diǎn)等(圖3)?;⑵~HSP70蛋白氨基酸序列與已經(jīng)公布的HSP70蛋白質(zhì)一級(jí)序列具有高度相似性(表3),表明PtHsp70基因高度保守。
熒光定量PCR結(jié)果表明,PtHsp70基因mRNA在成年虎皮魚的腦、鰓、肝臟和肌肉組織中的表達(dá)水平各不相同(圖4a)。在腦組織中,PtHsp70基因mRNA含量最低,鰓組織PtHsp70基因mRNA含量是腦組織的2.1倍(P<0.01),肌肉組織PtHsp70基因mRNA含量是腦組織的19.8倍(P<0.01),虎皮魚肝臟組織中PtHsp70基因mRNA含量最高,是腦組織的78.8倍(P<0.01)。研究表明,PtHsp70基因mRNA在虎皮魚體內(nèi)的表達(dá)水平具有明顯的組織特異性,表達(dá)水平依次為肝臟>肌肉>鰓>腦(圖4a)。
在低溫脅迫環(huán)境下,虎皮魚腦、鰓和肌肉組織PtHsp70 mRNA水平均表現(xiàn)為顯著上調(diào)(圖4b)。其中,腦組織PtHsp70基因mRNA水平在15、13 ℃條件下分別為對(duì)照組的15.3、18.6倍(P<0.01);鰓組織PtHsp70基因mRNA水平在15、13 ℃條件下分別是對(duì)照組的2.8和5.3倍(P<0.01);肌肉組織19、15、13 ℃處理組PtHsp70基因mRNA水平分別是對(duì)照組的8.8、10.9和15倍(P<0.01)。而在肝臟組織中,隨著溫度降低,PtHsp70基因表達(dá)水平呈先降后升的趨勢(shì),當(dāng)溫度至23 ℃和19 ℃時(shí),mRNA水平與對(duì)照組相比變化不顯著,當(dāng)溫度繼續(xù)降至15 ℃時(shí),mRNA水平僅為對(duì)照組0.4倍,溫度繼續(xù)降至13 ℃時(shí),PtHsp70基因mRNA表達(dá)水平反而呈上升趨勢(shì),是對(duì)照組的1.5倍(P<0.01)。
圖1 Hsp70基因cDNA序列比對(duì)結(jié)果
圖2 虎皮魚HSP蛋白氨基酸序列預(yù)測(cè)
圖3 虎皮魚HSP70蛋白氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
名稱登錄號(hào)描述序列位置E值PTZ00009PTZ00009熱激蛋白70 ku3~6430e+00HSP70pfam00012HSP70蛋白8~6140e+00HSPA1-2_6-8-like_NBDcd10233HSPA1-A/-B/-L/HSPA-2等的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域8~3830e+00prok_dnaKTIGR02350細(xì)菌分子伴侶蛋白DnaK (HSP70蛋白)8~6140e+00DnaKCOG0443大腸桿菌分子伴侶DnaK (HSP70蛋白) 1~6140e+00
圖4 PtHsp70基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平定量分析a.虎皮魚腦、鰓、肝臟和肌肉組織PtHsp70基因mRNA表達(dá)水平定量分析,其中以腦組織為對(duì)照組,所有樣品處理溫度均為27 ℃;b.低溫脅迫下虎皮魚各組織PtHsp70基因mRNA表達(dá)水平定量分析,每個(gè)組織中以27 ℃處理組作為對(duì)照組. 圖中所有數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差. *表示與對(duì)照組有顯著差異(P<0.01).
HSP70蛋白家族被兩種不同的基因編碼,一種是組成型的Hsc70基因,一種是誘導(dǎo)型的Hsp70基因,兩種基因的編碼蛋白均作為分子伴侶發(fā)揮重要作用,通常認(rèn)為誘導(dǎo)型Hsp70基因在機(jī)體和細(xì)胞應(yīng)對(duì)溫度脅迫的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。魚類中也存在組成型和誘導(dǎo)型的HSP70蛋白,特別是在冷水魚類和極地魚類中,普遍存在兩種類型的HSP70蛋白,分別被組成型Hsc70基因和誘導(dǎo)型Hsp70基因編碼[15-17]。而在熱帶魚類和溫帶魚類中發(fā)現(xiàn)的HSP70蛋白與其他脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的熱誘導(dǎo)型HSP70蛋白高度同源,相似性達(dá)到75%~80%,因此普遍認(rèn)為魚類HSP70蛋白屬于熱誘導(dǎo)型HSP70蛋白家族[18]。本研究克隆到含有完整編碼區(qū)的虎皮魚Hsp70(PtHsp70)基因,其cDNA序列高度保守,與斑馬魚、鯉魚、鯽魚、光唇魚等鯉科魚類的Hsp70基因cDNA序列相似度超過90%,其中與斑馬魚相似度最高(94%),因此推測(cè)本研究克隆到的PtHsp70基因cDNA與斑馬魚、鯉魚、鯽魚等的Hsp70基因同源。本研究預(yù)測(cè)PtHsp70基因cDNA序列共翻譯643個(gè)氨基酸,全序列包含典型的熱激蛋白保守結(jié)構(gòu)域,例如核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BAG/HSP70結(jié)合位點(diǎn)、NEF/HSP70結(jié)合位點(diǎn)等。
當(dāng)受到外界刺激時(shí),細(xì)胞中組成型Hsc70基因轉(zhuǎn)錄本水平不變或略有上升,而誘導(dǎo)型Hsp70基因從本底水平被大幅誘導(dǎo)表達(dá),這一過程由熱激因子1(HSF1)三聚體結(jié)合到Hsp70基因啟動(dòng)子區(qū)域介導(dǎo)[13]。本研究檢測(cè)了PtHsp70基因在虎皮魚不同組織中的本底表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)PtHsp70基因表達(dá)水平具有組織特異性,在肝臟和肌肉中的表達(dá)水平高于腦和鰓組織。
本研究中,虎皮魚肝臟PtHsp70基因mRNA本底表達(dá)水平非常高,是腦組織的78.8倍,表明PtHsp70基因在虎皮魚肝臟中有較高的本底表達(dá)水平。此前曾有報(bào)道,在伯氏肩孔南極魚(Trematomusbernacchii)、博氏南冰(Pagotheniaborchgrevinki)、南極綿鳚(Lycodichthysdearborni)等南極抗凍魚中[19],Hsp70基因普遍表現(xiàn)為高水平的組成型表達(dá),從而在魚類應(yīng)對(duì)長期低溫環(huán)境中發(fā)揮重要作用。HSP蛋白主要發(fā)揮分子伴侶的作用,幫助蛋白折疊[20],輔助多聚蛋白復(fù)合體組裝和解聚[21],參與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)[22]和降解[23],參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]等。當(dāng)HSP70蛋白處于二磷酸腺苷結(jié)合態(tài)時(shí),對(duì)多肽底物有高親和力,結(jié)合多肽底物;而當(dāng)HSP70蛋白處于三磷酸腺苷結(jié)合態(tài)時(shí),與底物的結(jié)合能力減弱[25-26]。由此推測(cè),虎皮魚肝臟PtHsp70基因高水平本底表達(dá)模式是為適應(yīng)肝臟作為主要代謝器官,及時(shí)應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫的需要。
HSP70蛋白作為分子伴侶,幫助初級(jí)多肽鏈正確折疊,介導(dǎo)變性蛋白質(zhì)的修復(fù)和降解,在幫助細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激的過程中發(fā)揮重要作用[27-29]。廣溫性魚類可能通過調(diào)控HSP70蛋白表達(dá),適應(yīng)棲息環(huán)境溫度變化,以抵御低溫脅迫造成的細(xì)胞和組織損傷,例如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[30]和南亞野鯪(Labeorohita)[31]肌肉組織Hsp70基因mRNA水平在低溫刺激后顯著上升;同樣,低溫刺激下斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)腦組織Hsp70基因表達(dá)上調(diào)[32],達(dá)氏鰉鰓組織Hsp70基因mRNA水平隨著溫度降低而逐漸升高,4 ℃時(shí)達(dá)到峰值[11]。Hsp70基因轉(zhuǎn)錄本水平上升意味著組織中HSP70蛋白合成增加,以抵御細(xì)胞損傷和凋亡。
而在狹溫性魚類中,對(duì)HSP70蛋白及其編碼基因的研究還比較少。南極魚類生活在穩(wěn)定的低于-1.9 ℃的環(huán)境中,溫度升高(5~6 ℃)時(shí)未檢測(cè)到HSP蛋白表達(dá);黃雀鯛是一種狹溫性熱帶珊瑚魚,高溫(34 ℃)脅迫下,Hsp70、Hsp90、Hsp40等Hsp基因mRNA水平無顯著變化[33]。因此過去認(rèn)為冷水性狹溫魚類可能缺失HSP蛋白[34],而在熱帶狹溫魚類中表現(xiàn)為組成型表達(dá),以適應(yīng)長期的熱應(yīng)激環(huán)境[35]。在本研究中,正常條件下狹溫?zé)釒~類虎皮魚Hsp70基因在肝臟中具有較高的本底表達(dá)水平,而低溫脅迫下腦、鰓、肝臟和肌肉組織PtHsp70基因表現(xiàn)為誘導(dǎo)型表達(dá),表明狹溫?zé)釒~類存在溫度誘導(dǎo)型的Hsp70基因。
以往研究中未見在狹溫性魚類中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型熱激蛋白基因的報(bào)道,一方面可能是因?yàn)楠M溫性魚類的研究比較少,而且這些研究往往集中于極地低溫魚類中,而對(duì)狹溫?zé)釒~類的研究非常匱乏;另一方面,組織樣本或脅迫溫度點(diǎn)比較少,如20~21 ℃低溫脅迫下斑馬魚Hsp70基因mRNA轉(zhuǎn)錄本水平無明顯變化[36-37],而16 ℃低溫脅迫下,斑馬魚熱激蛋白Hsc70基因mRNA水平顯著上調(diào)[38];最后,HSP蛋白家族基因種類繁多,這些Hsp基因有些屬于溫度誘導(dǎo)型,有些是保守型,例如大黃魚(Pseudosciaenacrocea)17個(gè)Hsp70基因中僅2個(gè)能被低溫誘導(dǎo)或抑制[39]。已報(bào)道的狹溫魚類Hsp基因僅是其中少數(shù),所以暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)溫度誘導(dǎo)型Hsp基因。
虎皮魚不同組織中PtHsp70基因表達(dá)水平均受到溫度影響,在腦、鰓和肌肉組織中,PtHsp70基因mRNA水平隨著溫度降低而逐漸升高,表現(xiàn)為溫度依賴性表達(dá)。因此認(rèn)為,PtHsp70基因具有作為虎皮魚響應(yīng)低溫脅迫分子標(biāo)志物的潛能。
綜上,本研究利用同源克隆和RACE克隆技術(shù)首次在虎皮魚體內(nèi)克隆到PtHsp70基因cDNA全序列,序列全長2317 bp,其中編碼區(qū)長度1932 bp,編碼643個(gè)氨基酸,與斑馬魚等鯉科魚類的Hsp70基因cDNA序列高度相似。PtHsp70在虎皮魚肝臟、肌肉、鰓和腦等不同組織中均有表達(dá),其中在肝臟中的表達(dá)水平最高;PtHsp70基因在虎皮魚不同組織中的表達(dá)水平均能被低溫顯著誘導(dǎo),具有誘導(dǎo)型表達(dá)的特征。PtHsp70基因在虎皮魚腦、肝臟和肌肉組織中,表現(xiàn)為明顯的溫度依賴性表達(dá),因此具有作為虎皮魚響應(yīng)低溫脅迫的分子標(biāo)志物的潛能。本研究證明,狹溫?zé)釒~類虎皮魚的Hsp70基因具有組織特異性低溫誘導(dǎo)型表達(dá)的特征。