馬越騰，朱國(guó)斌，張升校，李 寧

動(dòng)脈粥樣硬化是一種涉及免疫失衡的慢性炎癥疾病。T 淋巴細(xì)胞包括調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞( Treg 細(xì)胞) 和輔助性T 細(xì)胞( Th17 細(xì)胞) ，參與動(dòng)脈粥樣硬化中的慢性炎癥反應(yīng)，最終影響急性冠脈綜合征( acute coronary syndrome，ACS) 的發(fā)生和發(fā)展［1-2］。相關(guān)研究表明，Th17細(xì)胞是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的重要因素之一［3］，相反，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中發(fā)揮保護(hù)作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，一旦 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞被激活，它們分泌可抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β( TGF-β) 和白介素-10( IL-10) ，在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中發(fā)揮保護(hù)作用［5］。Th 細(xì)胞在冠狀動(dòng)脈斑塊破裂中發(fā)揮重要作用，有研究顯示，Th1 應(yīng)答通常通過(guò)分泌如干擾素-γ 的細(xì)胞因子擴(kuò)增促炎途徑，Th1 反應(yīng)可能加劇動(dòng)脈粥樣硬化，加速斑塊進(jìn)展。 Th2 細(xì)胞可產(chǎn)生調(diào)節(jié)炎癥的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-4( IL-4) 、白介素-6( IL-6) ，促進(jìn)體液免疫，當(dāng)Th1 /Th2 亞群失衡可能促進(jìn)ACS 的發(fā)生［6］。Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 失衡已證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化和ACS 的發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)［7］，其可能是ACS 的發(fā)生機(jī)制。本研究觀察ACS 病人外周血 Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞水平變化，并分析其與 TGF-β、IL-10、IL-6 水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2017 年 1 月—2018 年 7 月我院收治的105 例冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病人，其中穩(wěn)定型心絞痛( SA) 病人 30 例，男 17 例，女 13 例，年齡 44 ～ 81( 61.8±7.9) 歲; 非 ST 段抬高型 ACS( NSTEACS) 病人45 例，男 32 例，女 13 例，年齡 47～80( 64.7±8.9) 歲; ST段抬高型急性心肌梗死( STEAMI) 病人30 例，男21例，女 9 例，年齡 41 ～78( 61.3±9.4) 歲; 選取同期于我院心內(nèi)科入院時(shí)有胸部或心前區(qū)不適但癥狀不典型、心電圖大致正常及冠狀動(dòng)脈造影術(shù)后未出現(xiàn)明顯異常的30 例病人作為對(duì)照組，其中男12 例，女18 例，年齡44～80( 60.7±10.6) 歲。所有病人均對(duì)研究?jī)?nèi)容知情，且簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn): 穩(wěn)定型心絞痛( 運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)中向下傾斜或水平 ST 段壓低＞1 mm) 、NSTEACS( 胸部不適或心絞痛，ST 段壓低或T 波倒置和/或肌鈣蛋白I 和肌酸激酶同工酶升高) 、STEAMI( 肌鈣蛋白I 和肌酸激酶同工酶水平顯著升高，持續(xù)性ST 抬高) 均符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］; 均行冠狀動(dòng)脈造影。排除標(biāo)準(zhǔn): 合并心臟瓣膜病者、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病、彌散性血管內(nèi)凝血、肝腎功能衰竭、血栓栓塞性疾病、敗血癥等炎癥反應(yīng)期疾病;惡性腫瘤; 納入研究前6 個(gè)月內(nèi)接受類(lèi)固醇治療者。

1.3 采集血液樣本 抽取病人空腹肘靜脈血5 mL，將血液樣品收集到乙二胺四乙酸二鈉真空采血試管中。采用流式細(xì)胞術(shù)分析，離心后將收集的血漿保存于－80 ℃冰箱中待檢。

1.4 流式細(xì)胞分析 4 ℃條件下，使用單克隆抗體CD4-FITC、IL-17-PE、CD25-APC、FOXP3-PE。使用未經(jīng)稀釋的抗體，采用流式細(xì)胞儀( BD FACS Calibur 儀器) 分析染色的細(xì)胞，獲得細(xì)胞比例。抗體均購(gòu)于美國(guó)BD 公司。

1.5 TGF-β 和 IL-10、IL-6 水平 按照說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA 法) 定量檢測(cè)血 TGF-β、IL-10、IL-6 水平，試劑盒選用武漢博士德生物工程有限公司、Bio-Swamp 公司。TGF-β、IL-10、IL-6 的最小檢測(cè)濃度為6.25 pg /mL。ELISA 內(nèi)部測(cè)定和測(cè)定間變異系數(shù)分別＜5%和＜10%。

1.6 Gensini 得分 使用Gensini 冠狀動(dòng)脈評(píng)分系統(tǒng)，定量評(píng)估冠狀動(dòng)脈血管狹窄嚴(yán)重程度［9］。以最狹窄處為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算: 狹窄直徑＜25% 為 1 分，25% ～ 49% 為 2分，50% ～74%為 4 分，75% ～89%為 8 分，90% ～98%為16 分，≥99%為32 分。將病變分支得分乘以相應(yīng)系數(shù)，各病變分支得分之和為冠狀動(dòng)脈狹窄程度總得分。左主干冠狀動(dòng)脈、近端左冠狀動(dòng)脈前降支、中段左冠狀動(dòng)脈前降支、近端左回旋支、遠(yuǎn)端左回旋支、后降支、后側(cè)支相應(yīng)系數(shù)分別為 5，2.5，1.5，2.5，1，1，0.5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x ±s ) 表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間采用LSD-t 檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)性分析評(píng)估兩個(gè)連續(xù)變量的相關(guān)性。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4 組 Th17 和 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例比較 與對(duì)照組比較，SA 組、STEAMI 組、NSTEACS 組外周血Th17 細(xì)胞比例升高，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例降低( P ＜0.05) ; 與 SA 組比較，NSTEACS 組和STEAMI 組 外 周 血 Th17 細(xì) 胞 比 例 升高，CD4+CD25+Foxp 3+Treg 細(xì) 胞 比 例 降 低( P ＜0.05) ; STEAMI 組 Th17 細(xì)胞比例高于 NSTEACS 組( P＜ 0. 05 ) ，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì) 胞 比 例 低 于NSTEACS 組( P ＜0.05) 。詳見(jiàn)表 1。

表 1 4 組 Th17 和 CD4+ CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例比較( x ±s )

2.2 4 組 Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比較 對(duì)照組、SA 組、NSTEACS 組、STEAMI 組 Th17 /CD4+CD25+Foxp 3+Treg 分 別 為 ( 0 . 1 0 ± 0 . 0 3 ) 、( 0 . 2 5 ±0.11) 、( 0.83±0.24) 、( 2.56±1.45) ; 與對(duì)照組比較，SA組、STEAMI 組、NSTEACS 組 Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 升高，且 STEAMI 組高于 NSTEACS 組，NSTEACS組高于 SA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0.05) 。

2.3 4 組外周血 TGF-β、IL-10、IL-6 水平比較 STEAMI 組和 NSTEACS 組外周血 TGF-β 和 IL-10 水平均低于 SA 組和對(duì)照組，IL-6 水平高于對(duì)照組( P ＜0.05) ，且 STEAMI 組 TGF-β 和 IL-10 水平低于 NSTEACS 組( P ＜0.05) ，IL-6 水平高于 NSTEACS 組( P ＜0.05) 。詳見(jiàn)表2。

表 2 4 組外周血 TGF-β、IL-10、IL-6 水平比較( x ±s ) pg/mL

2.4 Th17 比例和 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例與細(xì)胞因子水平的相關(guān)性分析 ACS 病人Th17 細(xì)胞比例與 TGF-β 呈負(fù)相關(guān)( r = －0.545，P ＜0.05) ，與 IL-10呈負(fù)相關(guān)( r =－0.246，P ＜0.05) ，與 IL-6 呈正相關(guān)( r =0. 229， P ＜ 0. 05 ) 。 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例與 TGF -β 和 IL -10 呈正相關(guān)( r 值分別為0.462，0.246，P ＜0.05) ，與IL-6呈負(fù)相關(guān)( r =－0.335，P ＜0.05) 。

2.5 病人臨床資料與Th17 比例和CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例的相關(guān)性分析 NSTEACS 和STEAMI 病人，低密度脂蛋白膽固醇、Gensini得分、C-反應(yīng)蛋白與CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)( P ＜0.05) ; Gensini 得分和 C-反應(yīng)蛋白與 Th17 呈正相關(guān)( P ＜0.05) 。詳見(jiàn)表 3。

表3 病人臨床資料與Th17 和CD4+ CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞的相關(guān)性分析

3 討 論

免疫失衡導(dǎo)致的慢性炎癥反應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展已被國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，Steppich 等［10］研究顯示，與SA 病人相比，ACS 病人T 淋巴細(xì)胞水平顯著升高，這些T 淋巴細(xì)胞主要為CD4+T 淋巴細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞亞群 Th1 活化后可激活干擾素-γ( IFN-γ) ，促使巨噬細(xì)胞募集和活化，巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放金屬蛋白酶( MMP) ，使纖維帽變薄促使斑塊破裂，促進(jìn)斑塊形成和動(dòng)脈損傷［11］。T 淋巴細(xì)胞包括 Th17 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。有研究顯示，Tregs 細(xì)胞可分泌TGF-β、IL-10 等，對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生遏制作用［12］，CD4+ CD25+ Foxp3+Treg 細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中，可抑制炎癥反應(yīng)，減慢動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，具有保護(hù)作用［4］。在體外研究中，Mor 等［13］通過(guò)將Treg 特異性抗原轉(zhuǎn)移到Apoe-KO 小鼠體內(nèi)，影響動(dòng)脈粥樣硬化病變形成，造成斑塊破裂易損性降低，且T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到斑塊中的數(shù)量減少和膠原蛋白含量顯著增加，對(duì)冠狀動(dòng)脈起到保護(hù)作用，同時(shí)抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。Th 細(xì)胞在冠狀動(dòng)脈斑塊破裂中發(fā)揮重要作用，募集相關(guān)細(xì)胞因子聚集在血管受損區(qū)域，最終促使 ACS 發(fā)生［14］。因此，Th17 與 Treg 成為目前ACS 研究的熱點(diǎn)。Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 失衡已證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化和ACS 發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)。有研究顯示，ACS 病人 Th17 水平顯著增加，但Treg /Th17 比例、Treg 細(xì)胞數(shù)量和Treg 細(xì)胞功能顯著下降，Th17 /Treg 可能是 ACS 早期診斷的一個(gè)新指標(biāo)［3］。Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 失衡可能是 ACS的發(fā)生機(jī)制，探索其在ACS 中的表達(dá)對(duì)早期診斷、改善預(yù)后、探索發(fā)病機(jī)制方面具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，STEAMI 組和NSTEACS 組外周血 Th17 細(xì)胞比例、IL-6 水平升高，F(xiàn)oxp3+Treg 細(xì) 胞 比 例 、TGF -β 、IL -1 0 降 低 ( P ＜0. 05 ) 。 與 SA 組 和 對(duì) 照 組 比 較，STEAMI 組 和NSTEACS 組Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 升高，且STEAMI 組高于 NSTEACS 組，NSTEACS 組高于 SA 組( P ＜0.05) 。結(jié)果提示 ACS 病人中 CD4+CD25+Foxp3+Treg 水平降低，Th17 表達(dá)水平升高，兩者比例失衡，且STEAMI 失衡程度高于 NSTEACS。Liu 等［15］觀察 80例冠心病和31 例冠狀動(dòng)脈造影正常的對(duì)照病人外用血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞水平變化，發(fā)現(xiàn) 58 例ACS 病人 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞表達(dá)水平顯著低于SA 組和対照組，與本研究結(jié)果一致。張勇等［16］研究觀察79 例冠心病病人CD4+CD25+Foxp3+Treg、Th17水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACS 病人Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg高于正常對(duì)照組，認(rèn)為T(mén)h17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 比例失衡可能是ACS 進(jìn)展的機(jī)制之一，與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，NSTEACS 組和STEAMI 組Th17細(xì)胞比例與 TGF-β、IL-10 水平呈負(fù)相關(guān)( P ＜0.05) ，與IL-6 呈正相關(guān)( P ＜0.05) ; CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞與 TGF-β、IL-10 水平呈正相關(guān)( P ＜0.05) ，與 IL-6 呈負(fù)相關(guān)( P ＜0.05) 。再次得出 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞可能通過(guò)分泌TGF-β、IL-10 等細(xì)胞因子影響ACS 進(jìn)展，與 Wang 等［17］研究結(jié)果相符。Ma 等［18］觀察 67 例冠心病及25 例冠狀動(dòng)脈造影正常的對(duì)照組病人發(fā)現(xiàn)，其中51 例ACS 病人Th17 細(xì)胞表達(dá)水平增高，而CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞表達(dá)降低。為了探索炎性因子與Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg 在冠心病中的作用機(jī)制，觀察22 種細(xì)胞因子與Th17 /CD4+CD25+Foxp3+Treg關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6 與Th17 細(xì)胞水平呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

越來(lái)越多證據(jù)表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞活性、數(shù)量和功能的抑制特性，可能與脂蛋白分?jǐn)?shù)有關(guān)。有研究顯示，血清LDL-C 水平與Treg 細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，LDL-C 數(shù)量減少與CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞功能抑制有關(guān)［19］。本研究中，NSTEACS 和 STEAMI 病人LDL-C、 Gensini 評(píng) 分、 C-反 應(yīng) 蛋 白 與CD4+CD25+Foxp 3+Treg 細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)( P ＜0.05) ; Gensini 評(píng)分和 C-反應(yīng)蛋白與 Th17 呈正相關(guān)( P ＜0.05) ，提示 CD4+CD25+Foxp3+Treg 在 ACS 發(fā)展中發(fā)揮保護(hù)作用，Th17 發(fā)揮促進(jìn)作用。LDL-C 與其他研究所示與CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)是一致的，與Th17 細(xì)胞比例呈正相關(guān)。目前，這種表現(xiàn)的原因未闡明，此外本研究樣本量有限，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析。

綜上所述，STEAMI 和 NSTEACS 病人外周血Th17 /CD+CD+Foxp3+Treg 比例失衡，Th17、CD+4254CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例可能通過(guò)影響 TGF-β、IL-10、IL-6 水平影響 ACS 的進(jìn)展。