周曉敏，孟峻

(1．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

細(xì)胞分裂周期蛋白14(cell division cyclin 14，CDC14)是一種高度保守的絲/蘇氨酸雙重特異性磷酸酶，存在于多種生物體中[1]。CDC14磷酸酶最初是在篩查釀酒酵母細(xì)胞周期基因時由L.Hartwell發(fā)現(xiàn)并命名[2]。CDC14蛋白磷酸酶作為重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在真核生物G2(DNA合成后期)期阻滯中發(fā)揮穩(wěn)定的保守性作用。目前通過對酵母、秀麗隱桿線蟲、鳥類、非洲爪蟾和斑馬魚等不同真核生物的研究，CDC14已被證實(shí)廣泛參與有絲分裂、胞質(zhì)分裂、減數(shù)分裂、DNA損傷修復(fù)等生理、病理過程[3]。探討CDC14磷酸酶調(diào)控細(xì)胞周期的分子機(jī)制，可以為哺乳動物受精卵早期發(fā)育的機(jī)制研究提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，故本文對CDC14的結(jié)構(gòu)，生物學(xué)功能及其與CDC25之間的關(guān)系作一綜述。

1 CDC14的概述

眾所周知，蛋白的可逆性磷酸化在其生物學(xué)功能和控制真核生物的細(xì)胞分裂過程中均發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其中包括基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，細(xì)胞周期的調(diào)控，細(xì)胞骨架重排，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，細(xì)胞凋亡等。約有1/3真核生物的蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)生于絲氨酸和蘇氨酸殘基上，其磷酸化狀態(tài)是由激酶和磷酸酶之間的平衡所調(diào)節(jié)[4]。細(xì)胞周期調(diào)控中，CDC14磷酸酶通過下調(diào)細(xì)胞周期素依賴激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)磷酸化來控制胞質(zhì)分裂。CDC14在G2/M轉(zhuǎn)換時能下調(diào)CDK1的活性，其功能涉及有絲分裂后期的調(diào)控及退出有絲分裂和胞質(zhì)分裂。對酵母菌及人類骨肉瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，CDC14作為重要的細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控因子，其表達(dá)的缺失不僅會抑制DNA合成，還會阻礙細(xì)胞分裂[5]。CDC14在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)CDC14A和CDC14B 2種亞型。CDC14A在細(xì)胞分裂間期定位于中心體，具有調(diào)節(jié)中心體復(fù)制的功能，該功能的實(shí)現(xiàn)依賴于其與中心體的相互作用。CDC14B在細(xì)胞分裂間期定位于核仁，還有部分定位于中心體和紡錘體，CDC14B通過直接與微管結(jié)合達(dá)到保持主軸穩(wěn)定的作用。CDC14的研究成果可應(yīng)用于臨床、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，提高動物的繁殖數(shù)量，滿足人類對實(shí)驗(yàn)動物的需求；其次可以用于臨床上人類體外輔助生殖，通過CDC14/CDC25B途徑的調(diào)節(jié)，縮短受精卵體外培育時間，盡早植入人體子宮，減少外界因素對受精卵的影響；最后還可用于腫瘤的治療，通過過表達(dá)CDC14，使腫瘤細(xì)胞停滯在G2期，這樣可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長；由于G2期的腫瘤細(xì)胞對腫瘤化學(xué)治療藥物較敏感[6]，從而可以在G2期殺死腫瘤細(xì)胞。

對CDC14磷酸酶晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)了1個對底物具有特異性的A結(jié)構(gòu)域和1個包含蛋白-酪氨酸磷酸酶特征序列的具有催化功能的B結(jié)構(gòu)域[7]。CDC14磷酸酶均有1個高度保守、長度約350個氨基酸的N-末端結(jié)構(gòu)域。然而，CDC14磷酸酶的C-末端結(jié)構(gòu)域是有差別的，其長度和序列不同。CDC14的C-末端結(jié)構(gòu)域包含1個核輸出序列，在酵母同源體中還存在1個核定位序列[8]。

2 CDC14在不同真核生物細(xì)胞周期中的作用

細(xì)胞周期描述了細(xì)胞分裂的整個過程,該過程是由一系列細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)控制的,分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和分裂期(M期)[9]。在真核生物中，細(xì)胞周期蛋白被稱為調(diào)控細(xì)胞周期的變速器，而CDK被稱為細(xì)胞分裂的啟動者，只有二者結(jié)合形成CDK-Cyclin復(fù)合物才可以發(fā)揮作用[10]。不同的CDK-Cyclin復(fù)合物在特定的細(xì)胞周期階段形成，并參與S期與M期。CDC2/Cyclin B，又稱有絲分裂促進(jìn)因子(mitosis promoting factor，MPF)，CDC2 / Cyclin B復(fù)合體的激活，使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)從G2期到 M 期的轉(zhuǎn)變[11]。在細(xì)胞周期的大部分時間里，CDC14位于核仁中且處于非活性狀態(tài)，但在后期開始時，由于早期釋放網(wǎng)絡(luò)[12]和有絲分裂退出網(wǎng)絡(luò)[13]的連續(xù)作用，CDC14從核仁中釋放出來。有活性的CDC14通過破壞有絲分裂細(xì)胞周期蛋白Cyclin來促進(jìn)CDK失活。

不同真核生物中CDC1在細(xì)胞周期中發(fā)揮的作用略有不同。在釀酒酵母中，ScCDC14在分裂間期被限制在核仁中且為無活性狀態(tài)，在進(jìn)入分裂期時，ScCDC14從核仁進(jìn)入細(xì)胞核，使CDC2磷酸化的底物脫磷酸，從而無法激活MPF,導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯[14-17]。與釀酒酵母不同的是，在裂殖酵母中，CDC14的同源體纖維蛋白原樣蛋白1( fibrinogen-like protein，F(xiàn)lp1)/多聚腺苷酸因子1(cellodextrintransporter-like protein 1，CLP1)在有絲分裂中較ScCDC14更早從核仁中釋放出來，并且Flp1/Clp1一部分通過下調(diào)CDC25蛋白，使CDC25去磷酸化變得極其不穩(wěn)定從而降解，失去活性的CDC25無法激活MPF，細(xì)胞開始退出有絲分裂；另外還有一部分Flp1/Clp1直接促進(jìn)CDC2的Tyr15位點(diǎn)磷酸化從而降低CDK的活性[18]。

另外，人類基因組編碼2個CDC14，包括hCDC14A、hCDC14B[19]。hCDC14A在分裂間期時位于中心體，參與調(diào)節(jié)中心體的復(fù)制，從而參與染色體部分分離和胞質(zhì)分裂。hCDC14A可以與內(nèi)著絲粒樣蛋白相互作用并使其去磷酸化，參與染色體分離和細(xì)胞分裂的協(xié)調(diào)，有助于hCDC14在有絲分裂后期從著絲粒重新定位到紡錘體[20]。過表達(dá)的hCDC14A可使染色體分離不均、S期中心粒提早分離、畸變、形成多級紡錘體，在紡錘體中段或紡錘體一端保留未分離的染色體，從而導(dǎo)致有絲分裂后期產(chǎn)生DNA含量異常的細(xì)胞[21]。hCDC14B在分裂間期主要定位于核仁，它與有絲分裂的退出、核組織、有絲分裂、紡錘體組裝4個特定功能有關(guān)[22]。同時，hCDC14B在中心粒復(fù)制、調(diào)節(jié)G1期長度和G2期DNA損傷檢查點(diǎn)也發(fā)揮作用。過表達(dá)hCDC14B會使細(xì)胞核碎片在子細(xì)胞間異常分布致使紡錘體被破壞[23]。有關(guān)小鼠卵母細(xì)胞的研究表明，CDC14A在生發(fā)泡期定位于細(xì)胞核，在生發(fā)泡破裂后聚集于凝集的染色體周邊，在第1次減數(shù)分裂前期(M I)與第2次減數(shù)分裂中期(M Ⅱ)則聚集于整個細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)卵母細(xì)胞由M I到M Ⅱ的過渡，調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞成熟[24]。

3 CDC25B概述

CDC25家族在整個進(jìn)化過程中高度保守，與CDC14相同，也是一種絲氨酸和蘇氨酸雙特異性的磷酸化酶。在哺乳動物細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了3種CDC25磷酸化酶,分別為CDC25A、CDC25B和CDC25C，它們的長度為470～566個氨基酸，這些基因的同源基因首次在雞中被發(fā)現(xiàn)[25-26]。CDC25蛋白的序列分為2個區(qū)域，其中蛋白質(zhì)的N端部分被稱為調(diào)控域，在3種亞型之間高度分化，它包含許多參與調(diào)節(jié)磷酸酶活性的磷酸化位點(diǎn)，而且這種氨基末端部分還包含信號肽序列，控制細(xì)胞內(nèi)CDC25磷酸酶的定位[27]。另一區(qū)域?yàn)镃-末端結(jié)構(gòu)域，這部分結(jié)構(gòu)域更高度保守，結(jié)構(gòu)大約60%相似，其中包含磷酸酶的催化口袋[28]。CDC25磷酸酶包含典型模體“HCX5R”,H是高度保守的組氨酸殘基,C是半胱氨酸催化殘基,X5含有5個氨基酸殘基并彼此之間形成1個圓環(huán),所有的酰胺磷酸連接到該圓環(huán)上的磷酸化底物位點(diǎn),R是1個高度保守需要連接到磷酸化氨基酸底物的精氨酸。與其他蛋白磷酸酶不同的是，CDC25結(jié)構(gòu)顯示其活性位點(diǎn)極其微小，沒有明顯介導(dǎo)底物識別的特征，也沒有輔助環(huán)，無法顯示廣泛的蛋白連接位點(diǎn)[29-30]。

自從20世紀(jì)90年代早期發(fā)現(xiàn)了CDC25磷酸酶以來，它們參與細(xì)胞周期的調(diào)控已被廣泛記錄。最初提出CDC25A主要通過去磷酸化和活化CDK來控制G1/S期的轉(zhuǎn)變，而CDC25B和CDC25C是進(jìn)入有絲分裂的必要條件[31]。在G2/M期轉(zhuǎn)變過程中，CDC25B負(fù)責(zé)中心體處CDC2/CyclinB的初始激活。在DNA合成前期的后半部分，CDC2/CyclinB在細(xì)胞核中被CDC25C完全激活。但目前的研究表明，CDC25A、CDC25B及CDC25C在不同的細(xì)胞周期點(diǎn)起作用，CDC25A主要在G1/S期轉(zhuǎn)變時發(fā)揮作用，CDC25B可使CDC2的Thr14位點(diǎn)和Tyr15位點(diǎn)去磷酸化從而激活MPF，導(dǎo)致G2/M期轉(zhuǎn)變，CDC25C只在有絲分裂期才有活性，被CDC2/CyclinB高度磷酸化后，形成正反饋環(huán)[32]。另一方面，當(dāng)CDC25A過表達(dá)時可以加速細(xì)胞分裂，若通過干擾RNA下調(diào)CDC25A活性則會導(dǎo)致有絲分裂停滯[33]。此外，CDC25A過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生過早的染色體縮合，使有絲分裂被抑制[34]。這些研究均表明，CDC25家族成員是細(xì)胞周期連續(xù)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子，并在空間和時間上密切合作，完成細(xì)胞周期階段之間的轉(zhuǎn)換。

4 CDC14A與CDC25相互作用

對裂殖酵母的研究表明，在細(xì)胞進(jìn)入分裂期后CDC14能快速降解有絲分裂的誘導(dǎo)子CDC25，證明CDC25是CDC14的底物[35]。CDC25家族通過激活CDC2-Cyclin B1復(fù)合物參與G2/M期過渡的控制，CDC2受髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1(myelin transcription factor 1，Myt1)和Wee1激酶的復(fù)雜調(diào)控,通過磷酸化其三磷腺苷結(jié)合位點(diǎn)的2個鄰近殘基Thr14 和 Tyr15而使CDC2處于不活躍狀態(tài)。激活有絲分裂CDC2-Cyclin B1復(fù)合物的確切觸發(fā)因素尚不清楚，但可以確定的是絲分裂的進(jìn)入是通過Wee1/Myt1激酶和CDC25磷酸酶之間的平衡而決定。CDC14在體內(nèi)通過與CDC25結(jié)合使其去磷酸化而變的不穩(wěn)定從而使其降解，當(dāng)細(xì)胞開始有絲分裂后，CDC14能迅速下調(diào)CDC25活性，通過這一過程保證CDC2激酶的鈍化從而誘發(fā)細(xì)胞分裂。高表達(dá)的CDC14使細(xì)胞停滯于G2期，此時CDC25是去磷酸化的，降低CDC14的活性可使CDC25高度磷酸化并增加其穩(wěn)定性[36-39]。

VAZQUEZ-NOVELLE等[40]的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，人類CDC14A的過表達(dá)可顯著降低裂殖酵母細(xì)胞中參與有絲分裂的CDK活性，這可能是由于hCDC14使CDC25去磷酸化而降解，無法發(fā)揮作用，或hCDC14磷酸酶與CDC25結(jié)合，可能隔離了CDC25，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核；亦或者，hCDC14/CDC25的相互作用阻止了CDC25與有絲分裂的CDK復(fù)合物相互作用，消除正反饋環(huán)，或與其他能夠刺激CDC25活性的潛在激酶相互作用。所有這些可能的機(jī)制均為CDC14與CDC25之間的相互作用導(dǎo)致CDC25失活，進(jìn)而導(dǎo)致CDC25無法激活MPF從而退出有絲分裂。另外，hCDC14A和hCDC14B磷酸酶均可以修復(fù)部分由于Flp1缺陷所導(dǎo)致的功能障礙，但只有hCDC14A可以替代通過CDC25發(fā)揮作用的Flp1磷酸酶功能，這說明人類CDC14A磷酸酶具有與裂殖酵母CDC14相同的某些功能，可以使有絲分裂誘導(dǎo)因子CDC25去磷酸化。有研究證實(shí)，hCDC14A是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，阻滯G2/M期的過渡[41]。當(dāng)細(xì)胞處于G2期，hCDC14A位于核仁并且活性增強(qiáng)，直接與CDC25B結(jié)合，使其去磷酸化抑制其催化活性，導(dǎo)致CDC25B無法去磷酸化CDC2，從而無法激活MPF；當(dāng)hCDC14A高表達(dá)時，CDC2激酶的活性被抑制從而使細(xì)胞停滯于G2期，沉默hCDC14A基因細(xì)胞可快速通過G2/M轉(zhuǎn)換期，均充分說明hCDC14A磷酸酶通過調(diào)控CDC25B的活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換。目前只有裂殖酵母CDC14與人類CDC14是通過CDC14/CDC25來調(diào)控細(xì)胞周期，其他哺乳動物體內(nèi)二者是否有相互作用關(guān)系，這之中的關(guān)系到底如何發(fā)揮作用仍需做進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)

通過研究CDC14A/CDC25的相互作用，探索CDC14A/CDC25途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以為體外生殖提供靶位點(diǎn)，從而將其應(yīng)用于人類體外輔助生殖技術(shù)，使受精卵的體外培育時間盡量縮短，盡快植入子宮。另外，這種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對細(xì)胞的生長發(fā)育極其重要，一旦遭到破壞，將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前，關(guān)于CDC14A與CDC25的相互作用關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)，但許多信號通路仍未明確，這有待繼續(xù)深入研究，從而揭示其分子調(diào)控機(jī)制。