朱靜芳，田 歌，范 威，劉影影，張艷格，王 貴，吳衛(wèi)東

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南省空氣污染健康效應(yīng)與干預(yù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

全國空氣質(zhì)量調(diào)查結(jié)果顯示，1961～2013年1～11月霧霾總天數(shù)逐年增加，尤其是2013年，京津冀的平均霧霾天數(shù)為49.1 d，相比歷史同期的19.2 d，增長比例超過150%[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，中國大氣污染類型已經(jīng)逐漸由傳統(tǒng)的煤煙型向煤煙、機(jī)動車尾氣、揚(yáng)塵等復(fù)合型污染轉(zhuǎn)變[2-3]。公路交通運(yùn)輸業(yè)的飛速發(fā)展，使我國機(jī)動車保有量持續(xù)上漲，汽油、柴油在消耗的燃油中仍占絕對主導(dǎo)地位[4]?！吨袊鴻C(jī)動車環(huán)境管理年報(bào)(2017)》顯示，我國已連續(xù)8 a成為世界機(jī)動車產(chǎn)銷第1大國，其中柴油車占10.2%，柴油尾氣顆粒物排放量超過汽車排放總量的90%[5]。柴油尾氣顆粒吸附的大量有機(jī)化合物(如多環(huán)芳烴、硝基芳烴、雜環(huán)、醌、醛等)有較強(qiáng)的致突變和致癌作用[6-7]。已有研究對城市顆粒物進(jìn)行源解析，結(jié)果表明，揚(yáng)塵是城區(qū)大氣顆粒物的重要來源[8-10]。我國城市大氣污染主要表現(xiàn)為顆粒物污染，細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)(空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒物)是大部分地區(qū)霧霾頻繁、加重的重要原因[11]。已有關(guān)于柴油機(jī)尾氣顆粒物、城區(qū)揚(yáng)塵和PM2.5的毒性研究，但大多數(shù)研究是針對某種單獨(dú)顆粒物進(jìn)行，未在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行對比分析。本研究將體外培養(yǎng)的人肺腺癌Ⅱ型上皮細(xì)胞A549分別暴露于新鄉(xiāng)市冬季大氣PM2.5、柴油機(jī)尾氣顆粒物標(biāo)準(zhǔn)參考顆粒物DEP-Sagai和SRM 2975、城區(qū)揚(yáng)塵標(biāo)準(zhǔn)顆粒物SRM 1649等4種顆粒物，比較分析不同顆粒物的毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器RPMI-1640培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自河南天池生物科技有限公司,2.5 g·L-1胰蛋白酶、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，甲基噻唑基四唑(methl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司,三聯(lián)溶解液參照周建軍改良MTT方法配置[12]，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，人白細(xì)胞介素-8(interleukin，IL-8)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；TischTE-6070大流量顆粒物采樣器購自美國Tisch公司，Christ真空冷凍干燥機(jī)購自德國Christ公司，超聲波清洗機(jī)購自鄭州生元儀器有限公司，Enspire多標(biāo)記微孔板檢測儀購自美國Perkin Elmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PM2.5收集及顆粒物懸液制作PM2.5采集點(diǎn)為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院院系樓樓頂，緊鄰主要交通干道。采集時(shí)間為2016年11～12月，用玻璃纖維膜每日連續(xù)24 h采集PM2.5，采樣流速為 1.13 m3·min-1。采樣后將濾膜剪成2 cm×3 cm大小，浸入超純水中超聲震蕩15 min，重復(fù)3次，使顆粒物充分從膜上脫落，再經(jīng)真空冷凍干燥收集顆粒物。2種柴油機(jī)尾氣標(biāo)準(zhǔn)參考顆粒物(DEP-Sagai和SRM 2975)及城區(qū)揚(yáng)塵標(biāo)準(zhǔn)顆粒物SRM 1649由美國國家環(huán)?？偸瓠h(huán)境效應(yīng)國家實(shí)驗(yàn)室饋贈。上述顆粒物分別用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)混懸制成顆粒物懸液，超聲震蕩15 min后制成儲備液。體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)前，用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液將顆粒物儲備液稀釋成不同濃度的顆粒物懸液，在與細(xì)胞混合前超聲震蕩5 min。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)將A549細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、100 kU·L-1青霉素、100 g·L-1鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃下于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行單層貼壁傳代培養(yǎng)。隔日更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.3 MTT法檢測各組A549細(xì)胞活性用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×106L-1，接種于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為PM2.5組、DEP-Sagai組、SRM2975組和SRM1649組，分別加入PM2.5、柴油機(jī)尾氣標(biāo)準(zhǔn)參考顆粒物DEP-Sagai、柴油機(jī)尾氣標(biāo)準(zhǔn)參考顆粒物SRM 2975及城區(qū)揚(yáng)塵標(biāo)準(zhǔn)顆粒物SRM 1649等4種顆粒物懸液(以下簡稱PM2.5、DEP-Sagai、SRM 2975、SRM 1649)，每孔100 μL，每個顆粒物處理組設(shè)5、10、20、40、80 mg·L-14個濃度，每個濃度設(shè)6個平行孔。24 h后每孔加入5 g·L-1MTT 10 μL繼續(xù)孵育4 h,再加入三聯(lián)溶解液于37 ℃下過夜。采用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測吸光度值。同時(shí)設(shè)置陰性對照組(該組6個平行孔，每孔含細(xì)胞、1640培養(yǎng)基、MTT、三聯(lián)溶解液)、顆粒物對照組(該組6個平行孔，每孔含顆粒物懸液、MTT、三聯(lián)溶解液)和調(diào)零組(該組6個平行孔，每孔含1640培養(yǎng)基、MTT、三聯(lián)溶解液)。細(xì)胞存活率= (顆粒物處理組吸光度值-顆粒物對照組吸光度值)/(陰性對照組吸光度值-調(diào)零組吸光度值)×100%。細(xì)胞存活率越低，說明顆粒物對細(xì)胞的損傷程度越大。

1.3.4 各組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平檢測實(shí)驗(yàn)前1 d取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108L-1，按每孔1 mL接種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)細(xì)胞分為對照組、PM2.5組、DEP-Sagai組、SRM2975組和SRM1649組，每組設(shè)4個平行孔。4個顆粒物處理組分別加入終質(zhì)量濃度為5、10、20、40、80 mg·L-1的顆粒物懸液處理24 h，對照組不做處理。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照LDH試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 各組A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108L-1，按每孔1 mL接種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為對照組、PM2.5組、DEP-Sagai組、SRM2975組和SRM1649組。每孔加入500 μL RPMI-1 640培養(yǎng)液和1 μL活性氧熒光探針DCFH-DA，孵育20 min后，4個處理組(PM2.5、DEP-Sagai、SRM 2975、SRM 1649)每組每孔分別加入500 μL濃度為10、20、40 mg·L-1的顆粒物懸液，對照組每孔加入500 μLRPMI-1640培養(yǎng)基，暴露2 h。每孔加入 2.5 g·L-1胰蛋白酶200 μL消化細(xì)胞，將收集的細(xì)胞加入500 μL PBS混勻重懸，1 500 r·min-1離心 5 min，重復(fù)3次；最后以500 μL PBS混勻后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108L-1，按每孔1 mL接種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為對照組、PM2.5組、DEP-Sagai組、SRM2975組和SRM1649組。PM2.5組、DEP-Sagai組、SRM 2975組、SRM 1649組每孔分別加入10、20、40 mg·L-1顆粒物懸液1 mL，處理細(xì)胞24 h，對照組不做處理。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，使用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測吸光度值。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照 IL-8 檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組A549細(xì)胞存活率比較結(jié)果見表1。與陰性對照組相比，PM2.5組、DEP-Sagai組、SRM 2975組及SRM 1649組細(xì)胞存活率均降低，且隨著顆粒物濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)顆粒物濃度增加至 20 mg·L-1時(shí)，PM2.5組和DEP-Sagai組與陰性對照組細(xì)胞存活率比較差異開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SRM 2975組在顆粒物濃度為10、20、40、80 mg·L-1時(shí)細(xì)胞存活率均低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SRM 1649組在各濃度下細(xì)胞存活率與陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

顆粒物濃度為5 mg·L-1時(shí)，SRM 1649組細(xì)胞存活率低于其他3組(P<0.05)，PM2.5組、DEP-Sagai組及SRM 2975組細(xì)胞存活率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為10 mg·L-1時(shí)，PM2.5組細(xì)胞存活率高于SRM 1649組(P<0.05)，其余各顆粒物處理組細(xì)胞存活率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為20 mg·L-1時(shí)，各顆粒物處理組細(xì)胞存活率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為40 mg·L-1時(shí)，SRM 2975組細(xì)胞存活率顯著低于PM2.5組、SRM 1649組(P<0.05)，其余各顆粒物處理組細(xì)胞存活率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為80 mg·L-1時(shí)，PM2.5組細(xì)胞存活率高于SRM 2975組(P<0.05)。經(jīng)擬合優(yōu)度分析，PM2.5、DEP-Sagai、SRM 2975 和SRM 1649的LC50分別為124.54、75.00、53.80、110.90 mg·L-1。

表1 各組A549細(xì)胞存活率比較

組別n細(xì)胞存活率/%陰性對照組6100.00±6.71PM2.5組6 5 mg·L-194.83±3.64 10 mg·L-192.03±8.12 20 mg·L-179.60±2.58a 40 mg·L-174.84±9.03a 80 mg·L-167.66±10.73aDEP-Sagai組6 5 mg·L-199.57±11.70 10 mg·L-187.35±9.67 20 mg·L-174.44±10.37a 40 mg·L-168.33±12.88a 80 mg·L-149.82±10.37aSRM 2975組6 5 mg·L-194.41±5.03 10 mg·L-182.81±11.67a 20 mg·L-161.14±12.33a 40 mg·L-145.87±14.11acd 80 mg·L-140.02±13.22acSRM 1649組6 5 mg·L-176.03±5.14ab 10 mg·L-171.78±3.23ac 20 mg·L-166.70±9.22a 40 mg·L-164.33±4.83a 80 mg·L-158.12±10.42a

注：與陰性對照組比較aP<0.05；與PM2.5組、DEP-Sagai組、SRM 2975組比較bP<0.05；與PM2.5組比較cP<0.05；與SRM 1649組比較dP<0.05。

2.2 各組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平比較結(jié)果見表2。與對照組比較，PM2.5組在10、20、40 mg·L-1時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，SRM 2975組、SRM 1649組、DEP-Sagai組在各濃度時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且4組均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

顆粒物濃度為5、10 mg·L-1時(shí)，SRM 1649組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平顯著高于PM2.5組和SRM 2975組(P<0.05)，其余各顆粒物處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為20～80 mg·L-1時(shí)，SRM 2975組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平高于PM2.5組和DEP-Sagai組(P<0.05)，其余各顆粒物處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平比較

組別nLDH/(U·L-1)對照組487.10±5.69PM2.5組4 5 mg·L-1106.45±14.90 10 mg·L-1113.98±5.01a 20 mg·L-1133.33±22.54a 40 mg·L-1151.61±19.42a 80 mg·L-1166.67±9.74aDEP-Sagai組4 5 mg·L-196.77±8.55a 10 mg·L-1118.28±2.01a 20 mg·L-1144.09±17.93a 40 mg·L-1158.07±19.45a 80 mg·L-1179.57±11.26aSRM 2975組4 5 mg·L-1120.43±7.02a 10 mg·L-1140.86±10.35a 20 mg·L-1189.25±17.34abc 40 mg·L-1224.73±11.97abc 80 mg·L-1229.03±18.74abcSRM 1649組4 5 mg·L-1147.31±14.30ab 10 mg·L-1154.84±13.42ab 20 mg·L-1169.89±16.52a 40 mg·L-1189.25±10.42a 80 mg·L-1197.85±21.29a

注：與陰性對照組比較aP<0.05；與PM2.5組、SRM 2975組比較bP<0.05；與DEP-Sagai組比較cP<0.05。

2.3 各組A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較結(jié)果見表3。PM2.5組、SRM 2975組、SRM 1649組在20 mg·L-1時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對照組比較差異開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DEP-Sagai組在5 mg·L-1時(shí)ROS水平與對照組比較差異即開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

顆粒物濃度為5 mg·L-1時(shí),各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為10 mg·L-1時(shí)，DEP-Sagai組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于PM2.5組、SRM 2975組、SRM 1649組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PM2.5組、SRM 2975組、SRM 1649組細(xì)胞內(nèi)ROS水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為20、40 mg·L-1時(shí)，DEP-Sagai組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于PM2.5組、SRM 2975組、SRM 1649組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SRM 2975組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于PM2.5組和SRM 1649組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PM2.5組和SRM 1649組細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較

組別nROS/%對照組4100.00±11.78PM2.5組4 5 mg·L-1119.82±9.11 10 mg·L-1127.54±11.32 20 mg·L-1171.14±13.35a 40 mg·L-1235.01±25.82aDEP-Sagai組4 5 mg·L-1142.01±27.83a 10 mg·L-1151.07±14.00ab 20 mg·L-1298.57±23.44ab 40 mg·L-1455.56±23.96abSRM 2975組4 5 mg·L-1132.45±26.67 10 mg·L-1134.01±13.11 20 mg·L-1248.26±27.31ac 40 mg·L-1359.03±35.10acSRM 1649組4 5 mg·L-1103.27±12.80 10 mg·L-1119.56±12.22a 20 mg·L-1182.53±25.14a 40 mg·L-1260.45±28.31a

注：與陰性對照組比較aP<0.05；與PM2.5組、SRM 2975組、SRM 1649組比較bP<0.05；與PM2.5組、SRM 1649組比較cP<0.05。

2.4 各組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平比較

結(jié)果見表4。與對照組比較，PM2.5不同濃度組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DEP-Sagai組在20 、40 mg·L-1時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SRM 1649組在40 mg·L-1時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SRM 2975組在10、20 mg·L-1時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-8水平顯著高于對照組(P<0.05)，隨處理濃度升高，IL-8水平呈下降趨勢。

顆粒物濃度為10 mg·L-1時(shí)，PM2.5組和SRM 2975組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平高于DEP-Sagai組和SRM 1649組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。顆粒物濃度為20 mg·L-1時(shí)，各顆粒物處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。顆粒物濃度為40 mg·L-1時(shí)，PM2.5組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平均高于DEP-Sagai組和SRM 2975組和SRM1649組(P<0.05)，SRM 2975組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平均低于DEP-Sagai組和SRM1649組(P<0.05)。

表4 各組A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8水平比較

組別nIL-8/(pg·L-1)對照組4136.57±12.26PM2.5組4 10 mg·L-1336.05±9.51a 20 mg·L-1386.62±5.34a 40 mg·L-1483.58±6.51aDEP-Sagai組4 10 mg·L-1241.36±3.33bc 20 mg·L-1304.53±4.15a 40 mg·L-1369.85±7.89abcSRM 2975組4 10 mg·L-1356.73±13.57a 20 mg·L-1286.12±4.37a 40 mg·L-1204.66±8.56bSRM 1649組4 10 mg·L-1226.60±7.11bc 20 mg·L-1245.01±10.92 40 mg·L-1304.03±4.38abc

注：與陰性對照組比較aP<0.05；與PM2.5組比較bP<0.05；與SRM 2975組比較cP<0.05。

3 討論

國內(nèi)外關(guān)于大氣顆粒物暴露與人體健康效應(yīng)關(guān)系的研究結(jié)果表明，顆粒物表面吸附大量的有毒重金屬和多環(huán)芳烴等，會增加心、肺疾病的發(fā)病率和病死率[13-21]。大氣顆粒物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激以及局部或全身炎癥是造成呼吸和心血管系統(tǒng)組織損傷的主要生物學(xué)機(jī)制[22]。顆粒物表面的過渡金屬(如Fe、Cu、Cr、Ni、Zn)和有機(jī)物可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子激活、炎性趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)增加。這些炎性信號分子可進(jìn)一步上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，這些黏附分子相互識別進(jìn)而引起炎性細(xì)胞從血管進(jìn)入肺組織?；罨难仔约?xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生膜結(jié)合黃素蛋白、細(xì)胞色素B245 還原性輔酶Ⅱ氧化酶等，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸能催化O2生成超氧陰離子(O2·-)。這些活性氧化物被肺上皮細(xì)胞表面的超氧化物歧化酶催化產(chǎn)生活性相對較低的過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)，H2O2能夠穿過細(xì)胞膜而激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，或?qū)е缕渌鸕OS的產(chǎn)生。例如，在顆粒物過渡金屬存在時(shí)，H2O2可產(chǎn)生毒性更大的羥自由基(·OH)。肺部氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)及其相互作用是研究大氣顆粒物對肺組織損傷的關(guān)鍵。

由于顆粒物組成成分和來源不同,對顆粒物成分檢測的實(shí)驗(yàn)條件也不同，大氣顆粒物暴露如何誘發(fā)毒性效應(yīng)以及顆粒物成分在誘發(fā)毒性效應(yīng)中的作用尚未形成統(tǒng)一的認(rèn)識[23-26]。本研究選取國際上常用的幾種標(biāo)準(zhǔn)參考顆粒物，包括2種柴油機(jī)排放顆粒物(DEP-Sagai與SRM 2975)和城區(qū)揚(yáng)塵(SRM 1649)，與新鄉(xiāng)市大氣中PM2.5進(jìn)行毒性對比研究，以比較不同來源顆粒物的毒性效應(yīng)，效應(yīng)指標(biāo)主要選取細(xì)胞損傷指標(biāo)、與氧化應(yīng)激相關(guān)的ROS以及與細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)的炎性因子IL-8。本研究發(fā)現(xiàn)，不同顆粒物均可致A549細(xì)胞損傷，且該效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。顆粒物濃度為 40 mg·L-1時(shí)，4種顆粒物對細(xì)胞已存在較明顯的損傷，且損傷程度存在差異。當(dāng)細(xì)胞暴露于SRM 2975和SRM 1649時(shí)，細(xì)胞存活率下降最明顯，在 40 mg·L-1時(shí)活細(xì)胞數(shù)分別減少54.4%和 43.7%。顆粒物濃度為40 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率依次為SRM 2975SRM 1649>DEP-Sagai>PM2.5。這4種顆粒物的細(xì)胞損傷能力的差異可能與其理化性質(zhì)不同有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，DEP-Sagai顆粒物的平均粒徑約為 0.4 μm[27]，SRM 2975顆粒物在等滲緩沖液中平均粒徑約為 0.22 μm[27]，SRM 1649顆粒物在等滲緩沖液中平均粒徑約為0.28 μm[28]，提示顆粒物粒徑大小可能與其損傷作用有關(guān)。小粒徑顆粒物容易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮毒性作用。SRM2975含有較多的多環(huán)芳烴，SRM1649含有較多的鐵和銅[28-29]，成分不同可能誘發(fā)的毒性效應(yīng)也不同。

本研究還發(fā)現(xiàn)，顆粒物濃度為40 mg·L-1時(shí)，各種顆粒物誘發(fā)A549細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的能力依次為DEP-Sagai>SRM 2975> SRM 1649>PM2.5。柴油尾氣顆粒物表面的有機(jī)物如多環(huán)芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)可間接誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過細(xì)胞色素P450和二氫二醇脫氫酶發(fā)生生物轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生氧化還原活性醌，進(jìn)一步催化自由基的產(chǎn)生。DEP富含大量PAHs[30]，有研究表明，DEP的細(xì)胞毒性與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DEP誘發(fā)的氧化應(yīng)激[31]以及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶水平降低有關(guān)[32]。

炎性因子IL-8檢測結(jié)果與細(xì)胞毒性不一致，顆粒物濃度為40 mg·L-1時(shí)，4種顆粒物處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平依次為PM2.5>DEP-Sagai> SRM 1649>SRM 2975。SRM2975組隨顆粒物濃度增加IL-8水平反而降低，這可能是SRM 2975所致的細(xì)胞存活率降低和顆粒物本身對IL-8的吸附作用導(dǎo)致的。IL-8水平在高濃度顆粒物刺激下反而降低，之前也有文獻(xiàn)報(bào)道[33-34]，推測與富含金屬成分的顆粒物相比，IL-8更易被含碳顆粒(汽車尾氣顆粒和木柴燃燒顆粒)吸附；顆粒物不僅可吸附IL-8，對其他細(xì)胞炎性因子如細(xì)胞介素-1β、細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等也有影響。

綜上所述，4種顆粒物均可對A549細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，但產(chǎn)生毒性作用的方式和能力不同，這可能與顆粒物的粒徑、理化特性、吸附的金屬離子和有機(jī)物質(zhì)含量有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。