楊 莉，賀 靜，孫曉慧，烏宇亮

(1.涇河工業(yè)園長(zhǎng)慶油田職工醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710201；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710061)

病理性心肌肥厚是猝死、心力衰竭等心血管疾病的危險(xiǎn)因素，其涉及心肌細(xì)胞肥大、凋亡、自噬及炎癥反應(yīng)等相關(guān)機(jī)制[1]。尋找有效阻礙心肌細(xì)胞肥厚和凋亡的靶分子對(duì)改善心肌肥厚具有重要意義。研究證實(shí),微小核糖核苷酸(microRNA，miRNA)參與調(diào)控心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展[2]，miR-185在心肌肥厚模型中表達(dá)下調(diào)[3]，但其對(duì)心肌細(xì)胞肥大及凋亡的影響尚不清楚。心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)是心肌細(xì)胞肥大的標(biāo)志物，這些指標(biāo)升高表明存在心肌細(xì)胞肥大。細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,CDC42)是miR-185的一個(gè)靶分子，與心肌細(xì)胞肥大和凋亡有一定關(guān)系，其在壓力超負(fù)荷的心臟和體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中可被多種激動(dòng)劑包括血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)和異丙腎上腺素激活，具有心肌損傷作用?；罨投嗑巯佘斩姿岷颂蔷酆厦?poly ADP-ribose polymerase,PARP)和活化型caspase 3是細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)志物。本研究通過(guò)觀察miR-185對(duì)Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞中ANP、BNP、β-MHC和CDC42 mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡小體富計(jì)因子、活化型PARP和活化型caspase 3的影響，旨在探討miR-185影響心肌細(xì)胞肥大及凋亡的作用機(jī)制，為miR-185在心臟疾病防治中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供,凍存于含二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)中，液氮保存。

1.2 主要試劑與儀器Ang Ⅱ、青鏈霉素、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、FBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，miR-185模擬物(miR-185 mimic)和miR-185陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)定量SYBR Mix試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，TRIzol試劑盒、lipofactamine2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和胰蛋白酶細(xì)胞消化液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)志羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蛋白顯色液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，抗PARP、活化型caspase 3、CDC42抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，雙熒光素酶報(bào)告mRNA試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Coring公司，ABI 7500聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，低溫高速離心機(jī)和多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)取凍存的H9c2細(xì)胞，37 ℃溫水迅速融化，并懸浮于含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的DMEM中，混勻后轉(zhuǎn)移至新的離心管，1 000 r·min-1離心10 min，棄培養(yǎng)基，沉淀的細(xì)胞加入10 mL DMEM，混勻，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代2次后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染取傳代2次的H9c2細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為對(duì)照組、Ang Ⅱ處理組、陰性對(duì)照組和miR-185過(guò)表達(dá)組。對(duì)照組細(xì)胞采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)43 h；Ang Ⅱ 處理組細(xì)胞采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)19 h，給予0.1 μmol·L-1Ang Ⅱ處理24 h；陰性對(duì)照組細(xì)胞采用含50 pmol·L-1miR-185陰性對(duì)照的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)19 h，給予0.1 μmol·L-1Ang Ⅱ處理24 h；miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞采用含50 pmol·L-1miR-185 mimic的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)19 h，給予0.1 μmol·L-1Ang Ⅱ處理24 h。陰性對(duì)照組和miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞使用的轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-185及ANP、BNP、β-MHC、CDC42 mRNA表達(dá)取“1.3.2項(xiàng)”培養(yǎng)的各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)清洗3次，各孔加入1 mL TRIzol試劑，于冰上反應(yīng)10 min，提取細(xì)胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為：2×PCR緩沖液 12.5 μL，cDNA 1 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，SYBR Green I 0.5 μL,滅菌蒸餾水10.0 μL，總體積為25 μL。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，工作程序設(shè)定為：94 ℃預(yù)熱2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6作為miR-185的內(nèi)參，β-actin作為ANP、BNP、β-MHC和CDC42的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA和miR-185的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性取“1.3.2項(xiàng)”培養(yǎng)的各組細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，各孔加入100 μL PBS洗滌2次，加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液混勻；同時(shí)設(shè)置空白孔，加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液；37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度值(A)，細(xì)胞活性(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。其中A實(shí)驗(yàn)組代表對(duì)照組、Ang Ⅱ處理組、陰性對(duì)照組和miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞A值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況取“1.3.2項(xiàng)”培養(yǎng)的各組細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，胰蛋白酶消化后將細(xì)胞重懸于PBS中，800×g離心10 min，棄上清液，加入200 μL裂解液，室溫反應(yīng)30 min；800×g離心10 min。取20 μL上清液加至鏈霉親和素包被的微孔板中，再加入80 μL免疫反應(yīng)試劑(偶聯(lián)有過(guò)氧化物酶的抗-DNA單克隆抗體、抗組蛋白-生物素、溫育緩沖液，1118混合)，在搖床上避光室溫反應(yīng)2 h，棄上清液，加入250 μL溫育緩沖液清洗3次，棄上清。加入100 μL 2,2＇-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽，室溫孵育45 min。另設(shè)1個(gè)孔，加入100 μL 2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽作為空白對(duì)照孔(不含細(xì)胞裂解液)。于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔A值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果用凋亡小體富計(jì)因子表示，富計(jì)因子=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組)/A對(duì)照組。其中A實(shí)驗(yàn)組代表對(duì)照組、Ang Ⅱ入理組、陰性對(duì)照組和miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞A值。富計(jì)因子越大，表明細(xì)胞凋亡水平越高。

1.3.6 Western blot法測(cè)定各組細(xì)胞中活化型PARP、活化型caspase 3和CDC42蛋白表達(dá)取“1.3.2項(xiàng)”培養(yǎng)的各組細(xì)胞，PBS清洗3次，每孔加入80 μL蛋白裂解液，于冰上反應(yīng)15 min，收集細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度。每組取50 μg 蛋白樣品，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(dodecyl sulfate,sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳分離，采用200 mA恒流濕轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫條件下采用50 g·L-1牛血清白蛋白封閉1 h，加入抗PARP(1500)、活化型caspase 3(1500)、CDC42(11 000)和β-actin(15 000)一抗，4°C過(guò)夜孵育，加入羊抗兔二抗(15 000)室溫孵育2 h，每張膜上加入200 μL顯色液，進(jìn)行X膠片曝光顯影，采用Image J軟件分析各條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞中miR-185及ANP、BNP、β-MHC mRNA、CDC42 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中miR-185相對(duì)表達(dá)量顯著下降，ANP、BNP、β-MHC和CDC42 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ang Ⅱ處理組與陰性對(duì)照組細(xì)胞中miR-185及ANP、BNP、β-MHC、CDC42 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組比較，miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中miR-185相對(duì)表達(dá)量顯著升高，ANP、BNP、β-MHC、CDC42 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組細(xì)胞中miR-185及ANP、BNP、β-MHC、CDC42 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

組別nmiR-185ANP mRNABNP mRNAβ-MHC mRNACDC42 mRNA對(duì)照組31.02±0.020.96±0.020.98±0.031.12±0.041.02±0.03Ang Ⅱ處理組30.43±0.04a4.62±0.31a4.16±0.31a3.67±0.27a2.42±0.15a陰性對(duì)照組30.51±0.05a5.08±0.37a4.28±0.46a4.05±0.35a2.51±0.23amiR-185過(guò)表達(dá)組31.78±0.26bc3.01±0.12bc2.49±0.27bc2.16±0.18bc1.68±0.11bc

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與Ang Ⅱ處理組比較bP<0.05；與陰性對(duì)照組比較cP<0.05。

2.2 4組細(xì)胞活性比較對(duì)照組、Ang Ⅱ組、陰性對(duì)照組和miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活性分別為(100.03±1.29)%、(43.26±6.06)%、(36.18±4.27)%和(79.28±5.18)%。與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組細(xì)胞活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組與Ang Ⅱ處理組細(xì)胞活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組比較，miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 4組細(xì)胞凋亡情況比較對(duì)照組、Ang Ⅱ處理組、陰性對(duì)照組和miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡小體富計(jì)因子分別為0.12±0.02、0.56±0.06、0.49±0.04和0.39±0.04。與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡小體富計(jì)因子顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組與Ang Ⅱ處理組細(xì)胞凋亡小體富計(jì)因子比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組比較，miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡小體富計(jì)因子顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 4組細(xì)胞活化型PARP、活化型caspase 3和CDC42蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中活化型PARP、活化型caspase 3和CDC42蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組與Ang Ⅱ處理組細(xì)胞中活化型PARP、活化型caspase 3和CDC42蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Ang Ⅱ處理組和陰性對(duì)照組比較，miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中活化型PARP、活化型caspase 3和CDC42蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：Ang Ⅱ處理組；C：陰性對(duì)照組；D：miR-185過(guò)表達(dá)組。

圖1 4組細(xì)胞中活化型PARP、活化型caspase 3、CDC42蛋白的表達(dá)(Western blot)

Fig.1 Expression of cleaved PARP，cleaved caspase 3 and CDC42 protein in the four groups (Western blot)

表2 4組細(xì)胞中活化型PARP、活化型caspase 3和CDC42蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

組別n活化型PARP活化型caspase 3CDC42對(duì)照組31.02±0.030.95±0.031.01±0.02Ang Ⅱ處理組34.26±0.38a6.87±0.71a3.49±0.21a陰性對(duì)照組33.94±0.45a7.03±0.61a3.28±0.32aMiR-185過(guò)表達(dá)組32.38±0.25bc4.05±0.36bc1.54±0.15bc

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與Ang Ⅱ處理組比較bP<0.05；與陰性對(duì)照組比較cP<0.05。

3 討論

心肌肥厚分為生理性肥厚和病理性肥厚，生理性心肌肥厚常發(fā)生于兒童猛長(zhǎng)期、女性孕期及運(yùn)動(dòng)員，病理性心肌肥厚是由長(zhǎng)期的壓力負(fù)荷導(dǎo)致異常血流動(dòng)力學(xué)應(yīng)激、高血壓、心肌梗死等因素引起。早期心肌肥厚有利于維持正常心功能，但肥厚的心肌耗氧量增加，心肌順應(yīng)性降低，故長(zhǎng)期病理性心肌肥厚會(huì)引起心律失常、心力衰竭或者猝死，增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。研究證實(shí)，靶向抑制病理性心肌肥厚能夠有效改善心功能[4]，因此，如何阻礙心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展已成為研究熱點(diǎn)。心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，除壓力負(fù)荷外，交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、胰島素抵抗、自噬及氧化應(yīng)激均參與心肌肥厚的發(fā)展過(guò)程[5-6]。目前，研究者著重于探索能夠靶向阻礙心肌細(xì)胞肥大的分子或者藥物，Ang Ⅱ處理心肌細(xì)胞能夠建立體外心肌肥厚模型，可用于心肌肥厚發(fā)生機(jī)制的研究[7]。Ang Ⅱ是Ang Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶作用下產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)。有研究證實(shí)，Ang Ⅱ通過(guò)激活血管緊張素受體1，經(jīng)Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶途徑，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，導(dǎo)致心臟后負(fù)荷增加，引起心肌肥厚[8]。在Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中，心肌細(xì)胞肥大的標(biāo)志因子ANP、BNP和β-MHC表達(dá)顯著上調(diào)[9-10]。本研究中，Ang Ⅱ處理組細(xì)胞中ANP、BNP和β-MHC mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高，提示Ang Ⅱ成功誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞肥大；陰性對(duì)照組細(xì)胞中ANP、BNP和β-MHC mRNA相對(duì)表達(dá)量與Ang Ⅱ處理組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-185陰性對(duì)照對(duì)Ang Ⅱ造成的心肌細(xì)胞肥大無(wú)明顯影響。

MiRNA是一類長(zhǎng)度約20～24個(gè)核苷酸的小RNA，研究顯示，miRNA能夠作為疾病診斷及預(yù)后判斷的標(biāo)志物，同時(shí)，miRNA參與調(diào)控心血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-185通過(guò)調(diào)控癌細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、侵襲和遷移而參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展[12- 13]。有研究證實(shí)，Ang Ⅱ處理心肌成纖維細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞中miR-185表達(dá)水平下調(diào)[14]。目前，miR-185對(duì)Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究就miR-185對(duì)Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞肥大的作用進(jìn)行探討，結(jié)果顯示，Ang Ⅱ處理組細(xì)胞中miR-185表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)，提示miR-185可能參與調(diào)控Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷；Ang Ⅱ處理組與陰性對(duì)照組細(xì)胞中miR-185相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-185陰性對(duì)照對(duì)miR-185表達(dá)無(wú)明顯影響；同時(shí)，與AngⅡ處理組和陰性對(duì)照組比較，miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中miR-185相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而ANP、BNP和β-MHC mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，提示過(guò)表達(dá)miR-185可以抑制Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

Ang Ⅱ通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增殖而參與心臟重構(gòu)。體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Ang Ⅱ能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[15]，在體內(nèi)應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可以阻止心肌細(xì)胞凋亡[16]。細(xì)胞凋亡是心血管疾病中一個(gè)重要的病理過(guò)程，阻止或者減少心肌細(xì)胞凋亡是保護(hù)心肌細(xì)胞、改善心功能的一個(gè)重要措施。有研究顯示，miR-185促進(jìn)肺上皮細(xì)胞凋亡[17]；但在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型中，過(guò)表達(dá)miR-185可抑制心肌細(xì)胞凋亡[18]；這些研究表明，miR-185對(duì)不同細(xì)胞的作用不完全一致。Caspase家族成員在細(xì)胞凋亡中具有重要作用，其家族成員主要包括凋亡啟動(dòng)因子和凋亡執(zhí)行因子。Caspase 3是關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行因子，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，其活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志?；罨蚦aspase 3能夠?qū)ζ涞孜镞M(jìn)行切割，PARP就是活化型caspase 3的底物之一，被活化型caspase 3切割后，得到的活化型PARP也是細(xì)胞凋亡早期標(biāo)志因子[19-20]。因此，可以通過(guò)測(cè)定活化型caspase 3和活化型PRAP來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡水平。本研究結(jié)果顯示，Ang Ⅱ處理組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡小體富計(jì)因子顯著升高，活化型caspase 3和活化型PARP蛋白表達(dá)水平上調(diào)，表明Ang Ⅱ可以降低心肌細(xì)胞活性，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；陰性對(duì)照組與Ang Ⅱ處理組細(xì)胞活性及細(xì)胞中凋亡小體富計(jì)因子、活化型caspase 3和活化型PARP蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-185陰性對(duì)照對(duì)Ang Ⅱ造成的心肌細(xì)胞活性降低和凋亡無(wú)影響；與AngⅡ處理組和陰性對(duì)照組比較，miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活性增高，細(xì)胞凋亡小體富計(jì)因子顯著降低，活化型caspase 3和活化型PARP蛋白表達(dá)下調(diào)，提示miR-185過(guò)表達(dá)可以改善Ang Ⅱ?qū)е碌男募〖?xì)胞活性降低，抑制心肌細(xì)胞凋亡。

CDC42是腎素-血管緊張素系統(tǒng)同系物家族成員之一，具有心肌損傷作用。與野生型小鼠相比，特異性敲除心臟CDC42的小鼠在第2、8周心肌肥厚程度加重，并很快轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ遊21]。胚胎心肌細(xì)胞CDC42缺失會(huì)導(dǎo)致右心室發(fā)育不良[22]，且CDC42可促進(jìn)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[23]。CDC42在壓力超負(fù)荷的心臟和體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中可被多種激動(dòng)劑包括Ang Ⅱ和異丙腎上腺素激活。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ處理組細(xì)胞中CDC42 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高，提示CDC42參與Ang Ⅱ介導(dǎo)的細(xì)胞損傷；陰性對(duì)照組細(xì)胞中CDC42 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量與Ang Ⅱ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-185陰性對(duì)照對(duì)Ang Ⅱ造成的CDC42 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響；與AngⅡ處理組和陰性對(duì)照組比較，miR-185過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中CDC42 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，表明miR-185能夠抑制CDC42表達(dá)。

綜上所述，miR-185可能通過(guò)下調(diào)心肌細(xì)胞CDC42水平來(lái)減輕Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，抑制Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，改善心肌細(xì)胞活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。