徐紀(jì)明，毛文軒，何秋菊，姜小燕，毛傳澡

(浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，由于其在土壤中的含量較低，已成為影響作物產(chǎn)量的重要因素。隨著人口數(shù)量的增加，糧食的需求也在同步增加。當(dāng)前作物的高產(chǎn)很大程度上依賴(lài)于磷肥等肥料的大量施用。但是，只有大約10%～25%的磷肥能夠被當(dāng)季作物吸收利用，其余的磷肥則被土壤固定或進(jìn)入水體并導(dǎo)致環(huán)境污染[1]。水稻作為我國(guó)主要糧食作物之一，其產(chǎn)量的穩(wěn)定提升是國(guó)家糧食安全的重要保障。研究水稻磷吸收利用的分子生理機(jī)制，對(duì)于提高水稻磷養(yǎng)分吸收利用效率，培育磷高效水稻品種有重要意義[2]。

無(wú)機(jī)磷含量是分析水稻磷吸收代謝能力的重要指標(biāo)。無(wú)機(jī)磷的測(cè)定是水稻磷相關(guān)研究的必要方法，在突變體篩選、功能基因研究與品種磷效率評(píng)價(jià)等方面發(fā)揮著重要作用，其準(zhǔn)確性將直接影響相關(guān)的研究結(jié)論。目前，水稻中克隆的一系列磷吸收、代謝調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵基因，如PHR2、PHF1、SPX家族基因、PHO1、PHO2、PTs等的增強(qiáng)表達(dá)或突變體材料中無(wú)機(jī)磷濃度都發(fā)生了相應(yīng)的變化[3-5]。其中，PHO1、PHO2和PHF1都是通過(guò)測(cè)定突變體無(wú)機(jī)磷濃度篩選得到并定位克隆的[5-7]，而其他磷相關(guān)基因的功能研究也都離不開(kāi)無(wú)機(jī)磷含量的測(cè)定[8-10]。

水稻無(wú)機(jī)磷的測(cè)定方法主要有孔雀綠法和鉬藍(lán)法[11-13]等，測(cè)定方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定。但是在實(shí)際的無(wú)機(jī)磷測(cè)定過(guò)程中，尤其是在取樣過(guò)程中，會(huì)遇到一系列的問(wèn)題，如不同批次取樣時(shí)間不同，同批次測(cè)定樣品數(shù)量大、延續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、樣品存放條件不同，田間取樣如何存放，不同取樣部位是否對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響等等。闡明無(wú)機(jī)磷測(cè)定過(guò)程中的各種條件因子對(duì)無(wú)機(jī)磷濃度測(cè)定結(jié)果的影響對(duì)磷相關(guān)研究具有重要的意義。本研究以野生型水稻日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)作為研究對(duì)象，研究了取樣部位、取樣時(shí)間、保存條件和保存時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)磷測(cè)定結(jié)果的影響，以期為水稻和植物磷脅迫適應(yīng)機(jī)制的研究和磷高效作物新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用水稻品種日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻培養(yǎng)

野生型水稻Nipponbare種子用自來(lái)水洗凈后，用體積分?jǐn)?shù)0.7% HNO3破休眠處理18 h，37 ℃暗處催芽2 d至露白，將露白的種子播于浮在水稻培養(yǎng)液的網(wǎng)紗上。培養(yǎng)液中各成分為：0.091 mmol·L-1KNO3，0.183 mmol·L-1Ca(NO3)2，0.274 mmol·L-1MgSO4，0.183 mmol·L-1(NH4)2SO4，200 mol·L-1KH2PO4，1.0 mol·L-1MnCl2，3 mmol·L-1H3BO3，0.1 mol·L-1(NH4)6Mo7O24，0.4 mol·L-1ZnSO4，0.2 mol·L-1CuSO4，80 mol·L-1NaFe(Ⅲ)-EDTA，2 mmol·L-1MES (pH 5.5)，所有試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)(分析純)，在水稻生長(zhǎng)室中培養(yǎng)7 d后移到50 L水槽中繼續(xù)培養(yǎng)，3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，水稻苗間距為3 cm。水稻培養(yǎng)條件：07:00至19:00溫度30 ℃，19:00至07:00溫度22 ℃；環(huán)境相對(duì)濕度(Rh)為80%，光照強(qiáng)度24 000～36 000 lx。

盆栽采用統(tǒng)一規(guī)格的塑料桶，將均勻拌好肥料(氮肥用量為純N 0.2 g·kg-1土，磷肥用量為P2O50.15 g·kg-1土，鉀肥用量為K2O 0.15 g·kg-1土)的土壤按10 kg每桶進(jìn)行分裝。然后，將在營(yíng)養(yǎng)液里生長(zhǎng)約2周的野生型水稻移栽至土中，進(jìn)行淹水栽培，每桶1株，共10桶。分別取抽穗5 d(移栽75 d)和25 d(移栽95 d)的植株旗葉進(jìn)行無(wú)機(jī)磷測(cè)定。樣本統(tǒng)計(jì)數(shù)為5。

1.2.2 葉片無(wú)機(jī)磷提取

取水稻葉片并剪碎，放入已稱(chēng)量的2 mL離心管中，并稱(chēng)量，樣品與離心管總質(zhì)量減去離心管質(zhì)量得到樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量以50～100 mg為宜。離心管中加入氧化鋯珠子(直徑5 mm)和0.5 mL 5 mol·L-1H2SO4，使用球磨儀破碎勻漿后，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，并加入5 mL去離子水混勻，使用Whatman定量分析濾紙過(guò)濾后進(jìn)行無(wú)機(jī)磷濃度測(cè)定。

1.2.3 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定無(wú)機(jī)磷濃度

使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定水稻葉片無(wú)機(jī)磷濃度[14]。連續(xù)流動(dòng)分析儀為荷蘭SKALAR分析儀器公司SAN++三通道連續(xù)流動(dòng)分析儀。用含2 000 mg·L-1P的KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)磷溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e制成1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和30.00 mg·L-1P的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.4 取樣時(shí)間

在分析同一天內(nèi)不同時(shí)間對(duì)磷濃度的影響時(shí)，取樣時(shí)間設(shè)置起始時(shí)間為07∶00，每隔3 h取一次樣品，共取8次，取倒二葉作為測(cè)定對(duì)象。其他測(cè)定的取樣時(shí)間為10∶00。

1.2.5 取樣部位

野生型水稻長(zhǎng)至21 d苗齡時(shí)，最新一片完全展開(kāi)葉為倒一葉。不同葉片無(wú)機(jī)磷濃度分析時(shí)，分別取倒一葉、倒二葉、倒三葉和倒四葉進(jìn)行無(wú)機(jī)磷測(cè)定；葉片不同部位無(wú)機(jī)磷濃度分析時(shí)，取倒二葉作為測(cè)定對(duì)象。測(cè)定不同苗齡葉片無(wú)機(jī)磷時(shí)，取21、31、41 d苗齡的野生型倒二葉作為測(cè)定對(duì)象。測(cè)定開(kāi)花前和開(kāi)花后20 d的旗葉無(wú)機(jī)磷濃度時(shí)，以盆栽種植的野生型水稻旗葉作為測(cè)定對(duì)象。

1.2.6 鮮樣的保存條件和保存時(shí)間

在分析保存條件和保存時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)磷測(cè)定的影響時(shí)，將含有水稻葉片的離心管在室溫(25 ℃)和低溫(4 ℃)條件下放置0、4、8、12、24 h后，進(jìn)行無(wú)機(jī)磷測(cè)定。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18 軟件進(jìn)行單因素方差分析(Duncan)。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)磷含量的影響

數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計(jì)。下同。Results were shown as Data was detected based on fresh weight. The same as below.圖1 不同取樣時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)磷測(cè)定的影響Fig.1 Inorganic phosphate concentration of leaves sampled at different times

為確定取樣時(shí)間對(duì)水稻葉片無(wú)機(jī)磷含量的影響，分析了一天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)取樣樣品的無(wú)機(jī)磷濃度。結(jié)果如圖1所示，一天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的葉片無(wú)機(jī)磷含量有波動(dòng)，但是每個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間并沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明一天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)取樣對(duì)水稻葉片無(wú)機(jī)磷含量沒(méi)有影響。

2.2 不同取樣部位對(duì)無(wú)機(jī)磷含量的影響

對(duì)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的21 d苗齡野生型水稻倒一、倒二、倒三和倒四葉的無(wú)機(jī)磷濃度進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。水稻不同部位葉片的無(wú)機(jī)磷含量差異顯著，其中倒一葉無(wú)機(jī)磷含量最低，為0.69 mg·g-1，倒二葉無(wú)機(jī)磷含量為1.0 mg·g-1左右，倒三葉無(wú)機(jī)磷含量為1.16 mg·g-1，顯著高于倒二葉(P<0.05)，倒四葉無(wú)機(jī)磷含量最高，為1.30 mg·g-1。

為分析相同葉片不同部位無(wú)機(jī)磷含量是否存在差異，將野生型倒二葉分成3段，分別為葉尖、葉中部和葉基部，測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉中部無(wú)機(jī)磷含量比葉尖濃度稍高，但是沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，葉基部無(wú)機(jī)磷含量最低，比葉中部無(wú)機(jī)磷含量低19%，且差異顯著(P<0.05)。

以上結(jié)果說(shuō)明，不同葉序水稻葉片無(wú)機(jī)磷含量差異較大，顯示為新葉低，老葉高的趨勢(shì)，而且同一葉片不同部位無(wú)機(jī)磷含量也有差異，葉基部相對(duì)較低。

2.3 不同苗齡對(duì)無(wú)機(jī)磷含量的影響

不同苗齡水稻倒二葉的無(wú)機(jī)磷含量變化不大，均為1 mg·g-1左右(圖4-A)，說(shuō)明水培條件下不同苗齡水稻葉片無(wú)機(jī)磷含量保持穩(wěn)定，不隨著葉齡變化而發(fā)生波動(dòng)。開(kāi)花后水稻籽粒進(jìn)行灌漿，而灌漿所需的養(yǎng)分大部分來(lái)自于旗葉，為確定開(kāi)花前后旗葉無(wú)機(jī)磷含量的變化，分別取開(kāi)花前和開(kāi)花后旗葉進(jìn)行無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定。結(jié)果表明：開(kāi)花前旗葉無(wú)機(jī)磷含量為0.47 mg·g-1；開(kāi)花20 d后，灌漿完成，旗葉無(wú)機(jī)磷含量下降至0.23 mg·g-1(圖4-B)。

柱上無(wú)相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.圖2 不同取樣部位對(duì)水稻葉片無(wú)機(jī)磷含量的影響Fig.2 Inorganic phosphate concentration of different leaves and different tissues in a same leaf

數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差，**表示兩樣本之間存在極顯著差異(P<0.01)。下同。Results were shown as ±s(n=5). ** meant significant difference at the level of P<0.01. The same as below.圖3 不同苗齡葉片無(wú)機(jī)磷含量Fig.3 Inorganic phosphate concentration of leaves at different ages

2.4 取樣后保存條件和時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)磷含量的影響

無(wú)論是室溫還是低溫條件，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間放置后，葉片無(wú)機(jī)磷含量與放置0 h的含量沒(méi)有顯著差異，均為1 mg·g-1左右。說(shuō)明在取樣后24 h之內(nèi)，不同保存溫度下葉片無(wú)機(jī)磷含量沒(méi)有顯著差異；而且2個(gè)不同保存溫度下放置不同時(shí)間，葉片無(wú)機(jī)磷含量也沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明相對(duì)于低溫條件(4 ℃)，室溫保存(25 ℃)對(duì)水稻葉片無(wú)機(jī)磷含量沒(méi)有影響。

圖4 保存溫度和時(shí)間對(duì)水稻葉片無(wú)機(jī)磷含量的影響Fig.4 Effect of preservation temperature and time on inorganic phosphate concentration of leaves

3 討論

無(wú)機(jī)磷濃度是研究水稻磷吸收、代謝過(guò)程非常重要的指標(biāo)，反映了水稻對(duì)磷的吸收、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等能力，在突變體篩選、基因功能研究與遺傳育種材料的篩選評(píng)價(jià)中有重要的指導(dǎo)意義，其測(cè)定的準(zhǔn)確性直接影響人們對(duì)相關(guān)材料和相關(guān)基因功能的評(píng)價(jià)結(jié)果。本研究詳細(xì)分析了不同取樣時(shí)間、取樣部位、保存條件和保存時(shí)間，以及苗齡對(duì)水稻無(wú)機(jī)磷含量的影響，結(jié)果表明，不同取樣部位會(huì)對(duì)無(wú)機(jī)磷含量產(chǎn)生顯著影響，而不同取樣時(shí)間、取樣后在室溫或者低溫下短期保存(24 h內(nèi))均對(duì)無(wú)機(jī)磷含量沒(méi)有影響；不同苗齡對(duì)葉片無(wú)機(jī)磷含量沒(méi)有影響，而開(kāi)花前后旗葉無(wú)機(jī)磷含量會(huì)發(fā)生顯著變化。

磷是可再利用元素，老葉中的磷可經(jīng)過(guò)葉鞘、節(jié)等組織轉(zhuǎn)移到新葉中[15]。磷在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中是以無(wú)機(jī)磷的形式，通過(guò)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，老葉中無(wú)機(jī)磷濃度高于新葉，而新葉代謝旺盛，大量的磷被代謝利用，合成核酸、磷脂和核蛋白等物質(zhì)，導(dǎo)致無(wú)機(jī)磷含量相對(duì)較低。對(duì)大麥不同葉片無(wú)機(jī)磷測(cè)定結(jié)果顯示，從新葉到老葉，無(wú)機(jī)磷含量逐漸升高[16]，本研究結(jié)果與此一致，而且本研究中葉片不同部位無(wú)機(jī)磷含量也不相同，這也可能是因?yàn)槿~中部和葉尖代謝旺盛，光合作用強(qiáng)烈，因此需要穩(wěn)定、較高的無(wú)機(jī)磷濃度的保證，而葉基部細(xì)胞結(jié)構(gòu)特化，代謝較弱，要負(fù)責(zé)無(wú)機(jī)磷的運(yùn)進(jìn)和運(yùn)出，因此無(wú)機(jī)磷含量相對(duì)較低；另外，老葉中的磷會(huì)通過(guò)葉基部轉(zhuǎn)運(yùn)到更新的葉片中利用，這也可能是葉尖磷含量高于葉基部的原因。不同苗齡葉片無(wú)機(jī)磷測(cè)定結(jié)果顯示，不同苗期葉片無(wú)機(jī)磷含量變化不大，開(kāi)花20 d后，葉片無(wú)機(jī)磷主要轉(zhuǎn)移到種子中，因而開(kāi)花20 d后旗葉無(wú)機(jī)磷含量顯著降低。根據(jù)上述結(jié)果，測(cè)磷含量時(shí)要固定取樣部位，可選擇倒二葉進(jìn)行測(cè)定[17]，而且取樣部位要一致，這樣才能進(jìn)行不同材料或不同處理之間磷含量的比較。

在水稻無(wú)機(jī)磷測(cè)定過(guò)程中，有時(shí)會(huì)遇到測(cè)定樣品數(shù)量很大，或者異地取樣，造成樣品不能及時(shí)測(cè)定，一方面會(huì)導(dǎo)致取樣時(shí)間不同，另一方面樣品儲(chǔ)存時(shí)間也不同，儲(chǔ)存溫度條件也會(huì)波動(dòng)。本研究顯示，24 h內(nèi)不同時(shí)間取樣對(duì)無(wú)機(jī)磷測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響，不同時(shí)間點(diǎn)葉片無(wú)機(jī)磷含量也沒(méi)有顯著差異。取樣完畢將樣品放到離心管后，室溫或者低溫條件放置24 h對(duì)測(cè)定結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。首先因?yàn)殡x心管密封性好，放置過(guò)程中不會(huì)因?yàn)樗至魇Ф鴮?duì)質(zhì)量產(chǎn)生影響，其次可能是因?yàn)榈苟~已經(jīng)發(fā)育成熟，葉片細(xì)胞內(nèi)無(wú)機(jī)磷的消耗和產(chǎn)生達(dá)到平衡，取樣后24 h內(nèi)，無(wú)機(jī)磷濃度不會(huì)產(chǎn)生大的變化。具體原因需要進(jìn)一步研究確定。

本研究分析了取樣部位、取樣時(shí)間、保存條件、保存時(shí)間與苗齡等因素對(duì)水稻無(wú)機(jī)磷測(cè)定的影響，結(jié)果表明，取樣部位對(duì)無(wú)機(jī)磷測(cè)定結(jié)果影響較大，其他因素對(duì)結(jié)果沒(méi)有影響。在無(wú)機(jī)磷測(cè)定時(shí)需要主要注意取樣部位，按照本研究提供的方法，能得到準(zhǔn)確、一致的結(jié)果。本研究使用的材料為野生型水稻品種日本晴，在使用其他水稻品種或者其他植物，如玉米、小麥、煙草等進(jìn)行磷代謝相關(guān)研究中，也需要注意取樣部位不同對(duì)無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定帶來(lái)的影響。