姜媛媛，紀 藝，來勇敏，祝 旋，陳笑蕓，徐俊鋒，馬蓮菊，徐曉麗，*

(1.沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034； 2.浙江省農業(yè)科學院 農產品質量標準研究所 省部共建農產品質量安全國家重點實驗室，浙江 杭州 310021)

轉基因植物的一個重要性狀是抗蟲性，通常通過在轉基因植物中表達來自蘇云金桿菌(Bacillusthuringensis，Bt)的殺蟲晶體蛋白從而保護植物免受害蟲的危害，其靶標害蟲主要為鱗翅目和鞘翅目昆蟲[1]。我國是最早種植轉基因抗蟲農作物的國家之一，主要為轉基因抗蟲棉花。近年來，我國在其他轉基因抗蟲農作物的研發(fā)方面也取得了很大的進展，獲得了多個對鱗翅目昆蟲具有較高抗性的轉基因抗蟲水稻和玉米新品系[2-3]。轉基因植物獲得批準進行商業(yè)化種植前一定要進行環(huán)境安全評價，其中一個重要的方面是評價其對非靶標生物的影響。根據我國《轉基因生物安全評價指南》的要求，轉基因抗蟲植物需要提供對至少6種非靶標生物的安全評價結果。

蜜蜂是具有重要生態(tài)和經濟意義的傳粉昆蟲，主要采集植物的花粉、花蜜或脂類物質作為食物，意大利蜜蜂和中華蜜蜂是兩種重要的蜜蜂種類，可以為多種農作物授粉?；ǚ垡彩敲鄯涫澄镏形ㄒ坏牡鞍讈碓?，一個成年工蜂每日需攝入3.4～4.3 mg花粉[4]。通過取食花粉，蜜蜂有可能暴露于轉基因植物表達的外源殺蟲蛋白。因此，在轉基因抗蟲植物環(huán)境安全評價過程中，蜜蜂通常是最重要的指示生物[5-6]。通過在飼料中添加高于田間暴露水平、具有殺蟲活性的純蛋白或花粉，觀察蜜蜂的生長發(fā)育參數從而評價該抗蟲植物對其潛在的影響。大量對蜜蜂成蟲或幼蟲影響檢測的研究顯示：Bt抗蟲作物或Cry蛋白對蜜蜂的生長發(fā)育無顯著影響[7-15]。比如Hendriksma等[8]對表達Cry1A.105、Cry2Ab2和Cry3Bb1殺蟲蛋白的轉基因玉米MON 89034×MON 88017的研究顯示，取食轉基因玉米花粉對蜜蜂的生命表參數無顯著影響；Niu等[11]對轉基因抗蟲棉的研究顯示，表達Cry1Ac和Cry2Ab的抗蟲棉花對蜜蜂成蟲風險較低；Wang等[13]研究顯示，取食表達Cry2A或Cry1C的轉基因水稻花粉或純蛋白對蜜蜂成蟲的存活率和王漿腺發(fā)育沒有顯著不利影響。

轉cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米雙抗12-5是由浙江大學研發(fā)的轉基因玉米新品系，目前已獲得批準進入生產性試驗階段。室內和田間試驗顯示，其對玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲等靶標害蟲具有較高的抗性[16-17]。根據轉基因植物安全評價個案分析的原則，每一個轉基因植物新品系均需提供對非靶標生物的安全評價結果。在本研究中，首先通過對蜜蜂成蟲飼喂轉基因玉米雙抗12-5花粉的方式評價其對意大利蜜蜂成蟲可能產生的影響，之后又采用將蜜蜂成蟲直接暴露于高于花粉中Cry1Ab表達水平10倍的蛋白濃度，從而增加了檢測到不利影響的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗昆蟲和蛋白

試驗蜂群來自浙江省義烏市福堂鎮(zhèn)王煥興蜂場。選用新出房意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)成年工蜂，試驗前饑餓處理2 h。供試Cry1Ab蛋白購買于Envirologix公司，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗花粉

將轉基因玉米雙抗12-5及其非轉基因對照玉米種植于浙江省農業(yè)科學院海寧市轉基因植物試驗基地，轉基因玉米和非轉基因對照各種植3個小區(qū)，每小區(qū)150 m2。在玉米盛花期收集花粉，室溫下脫水24 h后，過200目篩并收集分裝到50 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 花粉試驗

將蜜蜂放置在正方體鐵架蜂籠中，每籠10頭，外圍網紗。將蜂籠放置于沒有光照的氣候室，溫度為(30±0.5)℃，相對濕度(70±1)%。試驗的飼料為添加不同濃度花粉的50%蔗糖溶液。滴管去管留頭，將食物添加進頭部后倒立放置于蜂籠網紗小孔處，便于蜜蜂取食?；ǚ墼囼炛校ǚ厶幚頌椋?)非轉基因對照玉米(瑞豐寶1號)花粉；2)轉基因玉米(雙抗12-5)花粉；3)蔗糖溶液；4)非轉基因對照玉米花粉與300 mg·L-1的吡蟲啉混合作為陽性對照。每籠10頭意大利蜜蜂，每個處理4籠，即4個重復，每天檢查意大利蜜蜂死亡情況并且更換飼料以保證蜜蜂每天暴露于新鮮花粉。飼喂14 d結束試驗。試驗過程中，第7和14天每處理取蜂2只，保存于-20 ℃冰箱，預備進行ELISA試驗檢測蜜蜂體內蛋白含量。

1.4 Cry1Ab蛋白試驗

以50%蔗糖溶液飼喂蜜蜂，并在蔗糖溶液中添加Cry1Ab蛋白、牛血清蛋白(BSA)或吡蟲啉，各處理分別為：1)含有8 μg·mL-1BSA的蔗糖溶液(陰性對照)；2)含有8 μg·mL-1Cry1Ab的蔗糖溶液；3)蔗糖溶液(空白對照)；4)含有300 mg·L-1吡蟲啉蔗糖溶液(陽性對照)。在該實驗中，Cry1Ab蛋白暴露濃度比轉基因玉米雙抗12-5花粉試驗中高10倍以上。每籠10頭意大利蜜蜂，每個處理4籠。每天觀察死亡情況并更換蔗糖溶液。試驗第7和14天每處理取蜂2只，保存于-20 ℃冰箱，預備進行ELISA試驗檢測蜜蜂體內蛋白含量。

1.5 取食量檢測

每日稱取各處理配置好的飼料并稱取質量M1，次日更換飼料前收集前一天剩余飼料并稱取質量M2，日取食量M=M1-M2，日平均取食量=M/活蟲數。

1.6 ELISA檢測

分別在花粉試驗和Cry1Ab蛋白試驗喂食第7和14天時各處理取2只蜜蜂用于ELISA檢測。采用美國ENVIROLOGIX公司Cry1Ab/Cry1Ac檢測試劑盒檢測。檢測前將蜜蜂用試劑盒中的洗滌液進行沖洗，除去蜜蜂體表粘附的花粉或蛋白。將組織勻漿后，參照試劑盒說明書進行檢測。采用酶標儀(美國伯樂680酶標儀)讀板，測定450 nm處吸光值，記錄數據。

1.7 數據分析

采用Excel對數據進行初步整理，并繪制蜜蜂的生存率曲線。采用SPSS 20.0進行差異性分析，取食量進行方差分析，若P<0.05，用Tukey’s HSD測驗進行多重比較。采用單因素方差分析比較蜜蜂體內蛋白含量，并通過Excel繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 花粉試驗

2.1.1 意大利蜜蜂的存活情況

飼喂蔗糖、轉基因玉米雙抗12-5花粉和非轉基因對照玉米花粉14 d后，各處理組仍有90%的蜜蜂存活(圖1)。飼喂300 mg·L-1吡蟲啉，所有蜜蜂4 d內全部死亡。飼喂轉基因玉米雙抗12-5花粉與非轉基因對照玉米花粉相比，意大利蜜蜂存活率沒有顯著差異(χ2檢驗；χ2=0，df=1，P=1.00>0.05)，飼喂吡蟲啉的存活率顯著低于普通花粉(χ2檢驗；χ2=83.077，df=3，P=0.000<0.05)。

2.1.2 意大利蜜蜂的取食情況

蜜蜂的取食量能直接反映蜜蜂的活性及整個蜂群的情況。飼喂蔗糖溶液、轉基因玉米雙抗12-5花粉和其非轉基因對照玉米花粉14 d后，取食量沒有顯著差異(ANOVA; df=2，P=0.366>0.05)。飼喂300 mg·L-1吡蟲啉，蜜蜂第2天出現拒食現象，取食量很少，顯著低于其他處理組(ANOVA;df=3，P=0.00<0.05)(表1)。由于蜜蜂長時間生活在蜂籠，運動少、耗能低，因此后期取食量低于前期。

2.1.3 蜜蜂對Cry1Ab的攝取量

ELISA檢測結果顯示，飼喂非轉基因對照玉米花粉和蔗糖溶液的蜜蜂體內并沒有檢測到Cry1Ab蛋白。飼喂轉基因玉米雙抗12-5花粉第7和14天時，蜜蜂體內蛋白含量分別為0.747和0.735 μg·g-1(圖2)。

2.2 Cry1Ab蛋白試驗

數據基于每次處理3次重復，每次重復10只個體蜜蜂。使用卡方檢驗比較存活率。Data was based on three replicates per treatment with 10 individual bees per replicate. Survival was compared using a Chi-Square test.圖1 不同花粉飼喂處理下意大利蜜蜂的生存分析Fig.1 Effect of different pollen feeding treatments on survival of Apis mellifera worker adults

表1 不同花粉飼喂處理對意大利蜜蜂日取食量的影響

Table1Effect of different pollen feeding treatments on daily consumptions ofApismellifera

時間Time/d蜜蜂日平均取食量Daily consumptions of Apis mellifera/g非轉基因玉米花粉Non-GM蔗糖Sucrose轉基因玉米花粉GM300 mg·L-1吡蟲啉Imidacloprid10.091±0.004 a0.107±0.009 a0.094±0.008 a0.011±0.003 b20.096±0.005 a0.107±0.013 a0.098±0.009 a0.005±0.002 b30.065±0.005 a0.076±0.002 a0.055±0.010 a0±0 b40.077±0.011 a0.078±0.003 a0.066±0.002 a0±0 b50.075±0.006 a0.071±0.006 a0.058±0.003 a0±0 b60.100±0.005 a0.113±0.001 a0.089±0.004 a0±0 b70.063±0.005 a0.067±0.006 a0.063±0.007 a0±0 b80.072±0.025 a0.084±0.004 a0.066±0.019 a0±0 b90.047±0.020 a0.051±0.005 a0.044±0.019 a0±0 b100.045±0.017 a0.056±0.014 a0.044±0.005 a0±0 b110.046±0.022 a0.060±0.012 a0.053±0.004 a0±0 b120.057±0.021 a0.061±0.005 a0.073±0.010 a0±0 b130.070±0.028 a0.078±0.016 a0.076±0.015 a0±0 b140.055±0.013 a0.057±0.009 a0.053±0.003 a0±0 b

表中數據為平均值±標準誤，同行數據后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05，Tukey’s HSD)。下同。

The date in the table were mean±SE. Date in the same line followed by different lowercase letters indicated the significant difference (P<0.05). The data was compared using a Tukey’s HSD test. The same as below.

圖2 飼喂轉基因玉米雙抗12-5花粉第7天和第14天蜜蜂體內Cry1Ab蛋白平均含量Fig.2 The mean concentrations of Cry1Ab protein in the bees after feeding on DR 12-5 pollen for 7 days and 14 days

2.2.1 意大利蜜蜂的存活情況

喂食300 mg·L-1吡蟲啉蔗糖溶液的蜜蜂在4 d內全部死亡(圖3)。用BSA(8 μg·mL-1)，Cry1Ab(8 μg·mL-1)和純蔗糖的蔗糖溶液喂食蜜蜂，各處理間存活率沒有顯著差異(Fisher檢驗；P=0.925>0.05)。結果表明，8 μg·mL-1的Cry1Ab對蜜蜂的存活率沒有顯著影響。

圖3 飼喂蔗糖、BSA、Cry1Ab和吡蟲啉蔗糖溶液后意大利蜜蜂生存分析Fig.3 Survival of Apis mellifera worker adults， after exposure to Cry1Ab， BSA or imidacloprid

2.2.2 意大利蜜蜂的取食情況

飼喂蜜蜂蔗糖、BSA(8 μg·mL-1)和Cry1Ab(8 μg·mL-1)第14天時，取食量情況為蔗糖組最多，BSA次之，Cry1Ab處理組略少于其他兩組，各組間取食量沒有顯著差異(ANOVA；df=2，P=0.51>0.05)。飼喂300 mg·L-1吡蟲啉取食量顯著低于其他處理組(ANOVA；df=3，P=0.00<0.05)(表2)。

2.2.3 蜜蜂對Cry1Ab的攝取

Cry1Ab (8 μg·mL-1)飼喂蜜蜂第7和14天時，Cry1Ab蛋白組平均每頭蜜蜂體內的蛋白含量為20.411和18.751 μg·g-1(圖4)。

3 討論

評價轉基因植物對非靶標節(jié)肢動物的影響是轉基因植物環(huán)境安全評價的重要內容，通常根據非靶標節(jié)肢動物暴露途徑采用相應的植物組織

表2 飼喂蔗糖溶液、BSA、Cry1Ab或吡蟲啉后意大利蜜蜂日取食量

Table2Mean daily consumption ofApismelliferduring 14-d chronic exposure to sucrose solution， Cry1Ab， BSA or imidacloprid

時間Time/d蜜蜂日平均取食量Daily consumptions of Apis mellifera/g蔗糖Sucrose8 μg·mL-1 BSA8 μg·mL-1 Cry1Ab300 mg·L-1吡蟲啉Imidacloprid10.111±0.003 a0.112±0.001 a0.110±0.003 a0.122±0.038 a20.108±0.005 a0.093±0.017 a0.087±0.012 a0±0 b30.101±0.012 a0.100±0.009 a0.059±0.050 a0±0 b40.095±0.012 a0.098±0.013 a0.089±0.014 a0±0 b50.094±0.010 a0.086±0.007 a0.098±0.009 a0±0 b60.085±0.009 a0.096±0.010 a0.104±0.072 a0±0 b70.108±0.013 a0.106±0.003 a0.090±0.011 a0±0 b80.114±0.002 a0.104±0.002 a0.089±0.004 a0±0 b90.097±0.011 a0.090±0.006 a0.093±0.008 a0±0 b100.099±0.009 a0.092±0.005 a0.090±0.002 a0±0 b110.080±0.035 a0.086±0.01 a0.083±0.004 a0±0 b120.116±0.025 a0.091±0.014 a0.090±0.010 a0±0 b130.079±0.014 a0.082±0.010 a0.071±0.005 a0±0 b140.094±0.017 a0.087±0.011 a0.078±0.006 a0±0 b

圖4 飼喂8 μg·mL-1Cry1Ab第7和14天時蜜蜂體內Cry1Ab蛋白含量Fig.4 Content of Cry1Ab in the bees after exposed to 8 μg·mL-1 Cry1Ab for 7 days and 14 days.

織或者將外源蛋白摻入飼料中飼喂受試生物從而進行評價。前者根據評價對象的取食方式選擇相應的植物組織，能比較準確地反映自然條件下的暴露情況，如蜜蜂作為花粉采集和取食者，花粉是其直接暴露于Bt蛋白的主要途徑，在大多數關于蜜蜂的安全評價試驗中，花粉試驗是主要試驗方法。本研究顯示，采用轉基因玉米雙抗12-5花粉喂食意大利蜜蜂工蜂成蟲第14天對其存活率和取食量沒有顯著影響，而吡蟲啉處理組的蜜蜂在4 d內全部死亡。蜜蜂取食轉基因玉米雙抗12-5花粉后，在其體內能檢測到Cry1Ab蛋白的存在，喂食第7和14天的檢測結果顯示，蜜蜂體內Cry1Ab蛋白含量比較穩(wěn)定。蜜蜂的取食量能直接反映蜜蜂的活性及整個蜂群的情況，花粉試驗中轉基因玉米雙抗12-5花粉處理和非轉基因對照玉米花粉處理對蜜蜂的取食量無顯著影響。這一結果與先前針對其他轉化體的研究結果一致[8，10，13，18-20]。

采用高劑量、具有生物活性的外源蛋白摻入受試生物飼料中進行飼喂試驗是非靶標節(jié)肢動物安全評價的另一重要手段，這一方法能增加受試生物的暴露濃度，通過模擬高于受試生物最壞條件下的暴露水平，增加了評價的嚴謹性[21]?；ǚ墼囼炛薪汦LISA檢測轉基因玉米雙抗12-5花粉中Cry1Ab表達量為11.212 μg·g-1，每只工蜂取食6.5 mg花粉進行飼喂[22-23]，每重復取食約728.78 ng Cry1Ab蛋白，1 mL的8 μg·mL-1的Cry1Ab溶液中Cry1Ab含量為8 000 ng，濃度高于10倍花粉中Cry1Ab蛋白含量。我們在試驗中采用了喂食Bt蛋白的方法。由于轉基因玉米雙抗12-5表達的外源蛋白為Cry1Ab/Cry2Aj融合蛋白，其殺蟲活性、殺蟲譜與Cry1Ab蛋白性質非常相似，因此本實驗采用8 μg·mL-1的Cry1Ab蛋白摻入蔗糖水中對蜜蜂進行飼喂，這一濃度高于雙抗12-5花粉中表達的蛋白濃度的10倍以上。結果顯示，取食8 μg·mL-1Cry1Ab對蜜蜂工蜂成蟲存活率和取食量沒有顯著影響，喂食第7和14天蜜蜂體內外源蛋白含量檢測結果分別為20.411和18.751 μg·g-1，高于花粉試驗中檢測到的蛋白水平(0.747和0.735 μg·g-1)，說明當蜜蜂暴露的蛋白濃度增加時，其攝取的蛋白量也增加。在蛋白試驗中，蜜蜂每日的取食量在各處理間沒有顯著差異，并且蜜蜂取食量在試驗前期與后期變化不大，這與花粉試驗中后期蜜蜂取食量下降有所不同。

蜜蜂因其重要的生態(tài)和經濟意義，一直是研究轉基因植物環(huán)境安全評價的最重要的非靶標生物。Duan等[7]對25種轉基因植物或其表達的Bt蛋白對意大利蜜蜂的影響進行了系統(tǒng)分析，結果顯示，轉Bt基因植物或其表達的Cry蛋白如Cry1A、Cry1F、Cry1Ba、Cry2A、Cry3A、Cry3B、Cry9C對蜜蜂成蟲或幼蟲無顯著影響。Dai等[12，24]的研究顯示，Cry1Ah、Cry1Ie對中華蜜蜂和意大利蜜蜂無顯著不利影響。Wang等[25]報道了表達Cry2A或Cry1C的轉基因水稻對意大利蜜蜂風險較低。本研究首次報道了轉基因玉米雙抗12-5對蜜蜂工蜂成蟲的潛在影響，研究結果與其他轉Bt基因植物的評價結果一致，再次證明了轉Bt基因植物對蜜蜂的安全風險較低，為轉基因玉米雙抗12-5的環(huán)境安全評價提供了理論依據。