吳西軍， 姚冬靜， 劉慶， 楊小燕， 王念雪， 王一慧， 舒莉萍， 何志旭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004； 3.河北省人民醫(yī)院 兒科， 河北 石家莊 050057； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 貴州 貴陽 550004； 5.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 兒童血液腫瘤科， 貴州 貴陽 550004)

cdh5在胚胎發(fā)育早期成體血管發(fā)生、血管重塑、內(nèi)皮連接及血管通透性調(diào)節(jié)等過程中有重要的作用[1-3]，同時(shí)在胚胎期造血發(fā)育過程中也有重要作用[4-6]。目前對cdh5的研究中，多采取的是斷面研究的方法，不能系統(tǒng)地展示cdh5基因在急劇變化的發(fā)育過程中的表達(dá)模式，而基因的正常表達(dá)模式是研究基因功能的基礎(chǔ)，因此研究cdh5基因的正常表達(dá)模式就顯得很有必要。由于大的模式生物多為體內(nèi)受精、宮內(nèi)發(fā)育，給持續(xù)、系統(tǒng)地觀察胚胎期基因的變化情況帶來了很多的限制[7]。本研究以野生型斑馬魚胚胎作為研究對象，利用其體外受精、宮外發(fā)育且系統(tǒng)發(fā)育高度保守的特性[8]，通過全胚胎原位雜交技術(shù)(whole-mount in situ hybridization, WISH)檢測cdh5基因在tǘebingen 野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)，獲得cdh5-mRNA的表達(dá)譜，探究cdh5-mRNA的表達(dá)模式，為探討cdh5基因在斑馬魚血管發(fā)生、發(fā)育及早期造血發(fā)育中的作用提供基因表達(dá)譜參照。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 野生型tǘebingen 斑馬魚系養(yǎng)殖在恒溫(28±0.5)℃的循環(huán)水系統(tǒng)，光照時(shí)間14 h/d，斑馬魚胚胎由課題組自行繁育。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑pCS2+真核生物表達(dá)質(zhì)粒和DH5α工程菌株由貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心保存，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑first- strand plus kit購于invitrogen公司，小提質(zhì)粒試劑盒購于Axyren公司，DNA凝膠回收試劑盒、DNA marker購于北京天根生物公司，PCR引物由上海捷瑞生物有限公司合成，EcoR1和Xba1 內(nèi)切酶、T4連接酶均購于fermentas公司，KOD DNA聚合酶購于TOYOBO 公司，地高辛RNA標(biāo)記和檢測試劑盒及NucAwayTMSpin Columns購自Ambion公司，BCIP/NBT購自VECTORLab。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1野生型斑馬魚總RNA的提取及cdh5基因克隆 以受精后小時(shí)數(shù)(hours-post-fertilization, hpf)作為斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)點(diǎn)的單位。收集Tuebingen野生型斑馬魚0.75、3.75、9、12、18、30、36、48、72 hpf多個(gè)時(shí)相點(diǎn)的胚胎，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)取5枚，置于1.5 mL的Epp管中，加入Trizol 1 mL充分勻漿處理，提取其總RNA、按SuperScriptTM111 First-Strand Systhcsis System kit試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)斑馬魚cdh5的基因序列(NM_001003983.1)，用primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，同時(shí)引入EcoR1以及 XbaⅠ酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基，cdh5基因上游引物為5′CGGAATTCTTCCAATCAGGGAAAACGAC-3′，下游引物為5′GCTCTAGACA GCTTTGCAAGGACAACAA-3′，由上海捷瑞生物有限公司合成。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行cdh5的RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后68 ℃后延伸10 min，產(chǎn)物大小為378 bp，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳鑒定完畢后將目的條帶割膠回收備用。

1.2.2pCS2+-cdh5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將cdh5基因的RT-PCR產(chǎn)物和pCS2+質(zhì)粒EcoR I和Xba I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，用T4酶連接回收的酶切片段，將連接產(chǎn)物運(yùn)用鈣轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)菌中，經(jīng)氨芐抗性篩選出陽性克隆并擴(kuò)增后，運(yùn)用堿裂解法提取pCS2+-cdh5 重組質(zhì)粒。鑒定pCS2+-cdh5 重組質(zhì)粒，(1)酶切，用 XbaⅠ單酶切或EcoR I及Xba I雙酶切pCS2+-cdh5 重組質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳，判斷酶切產(chǎn)物大?。?2)菌落PCR，pCS2+-cdh5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，PCR擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物大?。?3)序列測定，將重組質(zhì)粒送至北京諾賽生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定，得到測定序列后進(jìn)行序列比對。

1.2.3cdh5反義mRNA探針制備 將pCS2+-cdh5 重組質(zhì)粒用EcoR I酶切，DNA純化試劑盒割膠回收得到線性化的DNA片段。以線性化的pCS2+-cdh5 DNA片段為模板，以地高辛標(biāo)記的寡核苷酸為原料，經(jīng)T3RNA體外轉(zhuǎn)錄體系轉(zhuǎn)錄得到的cdh5反義mRNA探針；用NucAwayTMSpin Columns純化吸附柱回收cdh5反義mRNA探針，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分裝后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4野生型斑馬魚胚胎原位雜交 選取0.75、3.7、6、9、12、18、24、30、36、48及72 hpf的Tuebingen野生型斑馬魚胚胎進(jìn)行WISH，首先用l×PBST溶液洗去固定液，不同濃度的甲醇進(jìn)行梯度脫水后，胚胎68 ℃預(yù)雜交1 h，加入cdh5反義mRNA探針，于68 ℃雜交過夜，不同濃度的含吐溫20的檸檬酸鈉與氯化鈉緩沖液洗去過多的探針，加入地高辛抗體后過夜，含吐溫的馬來酸緩沖液(MABT)洗去過多的抗體，加入BCIP/NBT染液進(jìn)行染色，用固定液對雜交胚胎進(jìn)行固定并照相，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 cdh5 基因片段 RT-PCR擴(kuò)增

以收集的斑馬魚胚胎總 RNA 為模板，體外逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，RT-PCR 擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在對應(yīng)泳道可見一清晰的條帶，大小與預(yù)期 378 bp相符。見圖1。

注：1為DNA marker，2為cdh5 PCR產(chǎn)物，3為空白對照。圖1 cdh5 基因 RT-PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 RT-PCR product analysis of cdh5 gene

2.2 pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒酶切鑒定

pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒經(jīng) XbaⅠ單酶切及XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示，在pCS2+-cdh5和pCS2+泳道均可見一條帶，大小約4 100 bp，在cdh5基因片段及pCS2+-cdh5 XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切泳道均可見約378 bp大小的條帶，與目的基因條帶相符，表明目的基因cdh5 DNA片段成功插入pCS2+載體中。見圖2。

注：1為DNA marker，2為cdh5 PCR產(chǎn)物，3為pCS2+-cdh5雙酶切產(chǎn)物，4為pCS2+酶切產(chǎn)物，5為空白對照。圖2 pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒EcoRⅠ、 XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Digestion products of pCS2+-cdh5 recombinant plasmid by EcoRⅠ and XbaⅠ

2.3 pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒菌落 PCR 鑒定

以pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后菌液為模板， PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果顯示，對應(yīng)泳道可見約378 bp大小的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期相符，表明cdh5 基因片段成功插入了pCS2+質(zhì)粒中。見圖3。

注：1為DNA Maker，2為重組質(zhì)粒 PCR產(chǎn)物，3為空白對照。圖3 pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Colony PCR analysis of recombinant plasmid pCS2+-cdh5

2.4 pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒測序鑒定

pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒 DNA 經(jīng)序列測序，將測序結(jié)果在Genbank 中進(jìn)行比對，證實(shí)得到的序列與cdh5 基因序列完全一致。見圖4。

圖4 pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.4 DNA sequencing analysis of recombinant plasmid pCS2+-cdh5

2.5 野生型斑馬魚cdh5基因mRNA全胚胎原位雜交

野生型斑馬魚cdh5-mRNA原位雜交結(jié)果顯示，0.75 hpf的胚胎未見陽性雜交信號，3.7～12 hpf的胚胎可見cdh5-mRNA無特異性表達(dá)，18～36 hpf的胚胎cdh5-mRNA開始在血管和腦部高表達(dá)，特別是胚胎造血組織高表達(dá)，在18～24 hpf胚胎造血組織的中間細(xì)胞群、18～36 hpf胚胎尾部血島、30～36 hpf胚胎主動脈-性腺-中腎區(qū)及24～72 hpf胚胎的腦部組織中均可以觀察到dh5-mRNA陽性雜交信號。提示在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，cdh5-mRNA除在腦部和血管表達(dá)外，在造血組織中表達(dá)量亦較高，18 hpf已有明顯表達(dá)，30 hpf為其表達(dá)高峰，后逐漸減少。見圖5。

注：A～K示0.75～72 hpf,紅色箭頭所指為中間細(xì)胞群，藍(lán)色箭頭所指為主動脈-性腺-中腎區(qū)，綠色箭頭所指為尾部血島，黃色箭頭所指為腦部。圖5 0.75～72 hpf野生型斑馬魚胚胎cdh5-mRNA全胚胎原位雜交結(jié)果Fig.5 Whole-mount in situ hybridization using antisense cdh5-mRNA in zebrafish at different hours post-fertilization

3 討論

模式生物斑馬魚作為橋梁模式生物，具有體外受精、宮外發(fā)育、胚胎早期通體透明等特點(diǎn)，這些重要特征為研究生物體胚胎早期的生長發(fā)育以及組織器官的發(fā)生、發(fā)育提供了便利條件，可以對活體胚胎發(fā)育情況進(jìn)行系統(tǒng)的、連續(xù)的觀察和科學(xué)研究，是發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)等學(xué)科極為理想的模式生物[9-10]。WISH利用靈敏度較高的探針進(jìn)行標(biāo)記，技術(shù)簡單可靠性高，可以反映在胚胎發(fā)育整體水平中基因表達(dá)的三維時(shí)空性，被用于替代免疫組織化學(xué)研究和基于基因表達(dá)的胚胎期發(fā)育調(diào)控研究。

1990年在禽類研究中首先發(fā)現(xiàn)cdh5(CD144、VE-cadherin)，隨后在人和小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)了cdh5的存在，cdh5 在進(jìn)化中是高度保守的[11-12]。cdh5是一種跨膜蛋白，其胞外氨基端與相鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞上cdh5同型胞外結(jié)構(gòu)域互相黏附，胞內(nèi)梭基端與膜內(nèi)蛋白 P120、斑珠蛋白(plakoglobin)及?-catenin結(jié)合，可在所有類型的血管內(nèi)皮細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，一定程度上具有血管內(nèi)皮特異性。通過介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附連接在胚胎發(fā)育早期階段的血管發(fā)生和重塑過程中起關(guān)鍵作用[13-14]。

已有研究發(fā)現(xiàn)成血管細(xì)胞(flk1+cdh5-)和已經(jīng)定向了的內(nèi)皮細(xì)胞(flk1+cdh5+)都具有分化成造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)的能力，而flk1+Cdh5+的內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是HSC的直接來源[15]。在體外培養(yǎng)時(shí)cdh5+的細(xì)胞也可以發(fā)育為各系的造血細(xì)胞，體內(nèi)的研究也發(fā)現(xiàn)cdh5+的細(xì)胞在體內(nèi)可以發(fā)育成 HSC，并可以遷移到胎肝、骨髓等造血組織中[16-18]。通過對免疫缺陷小鼠進(jìn)行細(xì)胞移植的相關(guān)研究表明，cdh5+的細(xì)胞群比cdh5-細(xì)胞群顯示了更加出色的自我更新、增殖及分化潛能[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)提取了不同發(fā)育節(jié)點(diǎn)Tuebingen野生型斑馬魚胚胎總RNA，通過cdh5基因特異性引物，擴(kuò)增出了cdh5基因特異性的DNA片段，通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取等環(huán)節(jié)，得到了pCS2+-cdh5重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、質(zhì)粒菌落PCR及序列測定等方法鑒定，所得到的基因序列與cdh5基因序列完全一致；制備了cdh5基因特異性片段地高辛標(biāo)記的反義mRNA探針，用WISH檢測，結(jié)果表明cdh5-mRNA除在后腦和血管處表達(dá)外，在造血組織高表達(dá)，30 hpf為其表達(dá)高峰，后逐漸減少。

綜上所述，本研究明確了野生型斑馬魚cdh5-mRNA的表達(dá)模式，為研究cdh5-mRNA表達(dá)模式提供了參照，同時(shí)為研究cdh5在胚胎期發(fā)育調(diào)控中的作用提供支撐。但是mRNA的表達(dá)模式并不能完全代表蛋白質(zhì)的表達(dá)模式，利用帶標(biāo)記的cdh5抗體示蹤其表達(dá)情況將更為精確，但是目前尚未見斑馬魚cdh5抗體的相關(guān)報(bào)道，因此斑馬魚cdh5 mRNA的表達(dá)模式研究在目前就非常必要。