李哲銘， 劉冬冬， 陳攀， 趙伊立， 孫發(fā)， 邢俊平， 唐開發(fā)*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 泌尿外科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院， 貴州 貴陽 550004； 3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 泌尿外科， 陜西 西安 710061)

引起男性不育的因素有很多，根據(jù)生殖環(huán)節(jié)可分為睪丸前、睪丸、睪丸后三大因素，特發(fā)性男性不育是指致病原因不明的不育，可能通過其中的一個或多個因素引起[1]?；钚匝?ROS)是正常生理過程的產(chǎn)物，正常水平的ROS有利于維持精子獲能及頂體反應(yīng)等精子生理功能，而高水平ROS可通過破壞精子結(jié)構(gòu)引起男性不育[2-4]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GSTs)能促進(jìn)親電子物質(zhì)及應(yīng)激氧化產(chǎn)物與還原型谷胱甘肽結(jié)合，維持氧化還原系統(tǒng)的動態(tài)平衡[5-6]。GSTT1、GSTM1和GSTP1基因編碼Theta、Mu和Pi亞型酶，其不同基因型在人群中存在功能差異[7-8]，影響GSTs酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平的差異[9]。本研究分析GSTT1、GSTM1及GSTP1基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育患者氧化應(yīng)激水平及精子DNA氧化損傷之間的關(guān)系，為臨床特發(fā)性男性不育癥患者的診療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2008年9月-2012年6月泌尿外科門診就診的246例特發(fā)性男性不育癥患者作為受試對象，年齡21～34歲、平均(27.0±3.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有規(guī)律性生活1年以上，未采取任何避孕措施女方未受孕；(2)常規(guī)進(jìn)行2次或以上精液分析，精子密度小于15×106/mL或精子總數(shù)小于39×106，精子前向活率小于32%[10]。排除已知原因如外傷、隱睪癥、生殖系統(tǒng)感染、染色體核型異常、輸精管道梗阻及血清性激素水平異常等導(dǎo)致的不育。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1GSTT1、GSTM1、GSTP1基因分型 抽取研究對象外周靜脈血3 mL，嚴(yán)格按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。參照文獻(xiàn)[11]，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對GSTT1、GSTM1進(jìn)行基因分型，采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)對GSTP1基因進(jìn)行分型，GSTT1、GSTM1、GSTP1及β-actin基因引物均由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。GSTT1基因上游引物為5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′、下游引物為5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′，GSTM1基因上游引物為5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′、下游引物為5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′，GSTP1基因上游引物為5′-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3′、下游引物為5′-TGAGGGCAC AAGAAGCCCCT-3′；β-actin為內(nèi)參照，上游引物為5′-ACTCCCCATCCCAAGAC C-3′、下游引物為5′-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′[11]。采用Biomltra梯度PCR儀對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(GSTM1 60 ℃，GSTT1 63 ℃，GSTP1 58 ℃，β-action61 ℃)，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用BsmAI(ALW26I)限制性內(nèi)切酶對GSTP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2精漿及精子DNA中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測 精液采集方法按第4版《WHO人類精液及精子-宮頸黏液作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》[10]標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行：禁欲3～7 d，用手淫法采集精液置于干燥無菌取精杯中，用Chelex-100提取精子總DNA；將精液置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)液化，1 000 r/min離心獲得精漿，采用ELISA法測定精漿中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、總抗氧化能力(T-AOC)水平以及精子DNA中8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)水平，嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GSTT1、GSTM1、GSTP1基因多態(tài)性

如圖1、圖2所示，GSTT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度為480 bp，GSTM1基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度為219 bp，GSTP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度為177 bp；經(jīng)BsmAI(ALW26I)限制性內(nèi)切酶酶切后，野生型(A/A)產(chǎn)物長度為177 bp，突變純合型(G/G)產(chǎn)物長度為87 bp及90 bp，突變雜合型(A/G)產(chǎn)物長度為177 bp、87 bp及90 bp，β-actin內(nèi)參照擴(kuò)增產(chǎn)物長度為400 bp。246例特發(fā)性男性不育患者中，GSTM1(+)及GSTM1(-)患者分別為97、149例，GSTT1(+)及GSTT1(-)患者分別為92、154例，GSTM1/GSTT1(+/+)、GSTM1/GSTT1(+/-)、GSTM1/GSTT1(-/+)及GSTM1/GSTT1(-/-)患者分別為38、59、54及95例，GSTP1(A/A)GSTP1(A/G+G/G)及患者分別為167、79例。

注：泳道1為陰性對照，泳道2、12為GSTM1/GSTT1(+/+)，泳道3、7、8為GSTM1/GSTT1(-/-)，泳道4、9為GSTM1/GSTT1(+/-)，泳道5、6、10、11為GSTM1/GSTT1(-/+)，M為50 bp DNA maker。圖1 GSTs酶GSTT1及GSTM1基因擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis for glutathione S-transferase M1 and T1 gene polymorphisms

注：泳道1為陰性對照，泳道2、6為突變純合型(G/G)，泳道3、4、9、11為野生型(A/A)，泳道5、7、8、12為突變雜合型(A/G)，M為50 bp DNA maker。圖2 GSTs酶GSTP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BsmAI(ALW26I)酶切后凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis for GSTP1 gene amplification products digestion by BsmAl enzyme

2.2 GSTT1、GSTM1、GSTP1基因多態(tài)性與精液氧化應(yīng)激水平

GSTM1(-)組精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平顯著高于GSTM1(+)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GSTT1(-)組精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平顯著高于GSTT1(+)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GSTM1/GSTT1(-/-)組精漿MDA、NO及精子DNA中8-OH-dG水平高于GSTM1/GSTT1(+/+)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，精漿T-AOC水平低于GSTM1/GSTT1(+/+)組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GSTP1(A/G+G/G)組精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平高于GSTP1(A/A)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，精漿T-AOC水平明顯低于GSTP1(A/A)組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

3 討論

既往研究認(rèn)為氧化應(yīng)激(OS)是影響生殖能力的重要因素之一，精子像其他細(xì)胞一樣會產(chǎn)生自由基和活性氧物質(zhì)[12]。OS是機(jī)體產(chǎn)生的ROS水平和機(jī)體抗氧化水平之間失去平衡后導(dǎo)致的結(jié)果。低水平的ROS被認(rèn)為是精子的受精、頂體反應(yīng)及獲能過程所必須，同時(shí)低水平的ROS引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的改變，從而促進(jìn)精子和卵母細(xì)胞的交互融合[13-14]。正常生育男性精液中ROS與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)某些病理因素導(dǎo)致該平衡被打破后，過量的ROS可誘發(fā)精子DNA損傷、精子線粒體膜受損、精子活力下降、畸形精子增多及精子細(xì)胞凋亡等,從而導(dǎo)致男性不育[2,15]。

表1 特發(fā)性男性不育患者GSTT1、GSTM1、GSTP1基因多態(tài)性與精液氧化應(yīng)激水平的關(guān)系Tab.1 The oxidative stress levels in GST genotype groups

注：與野生型(+、+/+或A/A)比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

GSTs屬于機(jī)體Ⅱ相解毒酶系統(tǒng)，是人體抗氧化系統(tǒng)最重要的成員之一，其可以催化外源性化學(xué)物質(zhì)和內(nèi)源性ROS及其代謝產(chǎn)物與還原性谷胱甘肽結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)這些有毒物質(zhì)的代謝與滅活，減少對細(xì)胞的損害[16-17]。既往研究發(fā)現(xiàn)GSTs的基因多態(tài)性可影響其酶分子結(jié)構(gòu)，從而影響酶的活性[18]。前期通過對精索靜脈曲張患者GSTs基因分型及精液氧化應(yīng)激水平測定，發(fā)現(xiàn)GSTM1及GSTT1基因缺失型的精索靜脈曲張患者對氧化應(yīng)激的敏感性較基因野生型患者明顯增高[11]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性男性不育癥患者中，GSTM1及GSTT1基因多態(tài)性影響精子對氧化損傷的易感性[19-20]。

本研究采用ELISA方法對246名特發(fā)性男性不育癥患者的精漿MDA、NO、T-AOC及精子DNA中8-OH-dG水平進(jìn)行檢測，同時(shí)對這些患者進(jìn)行GSTs基因多態(tài)性測定。通過對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性男性不育患者中GSTM1(-)及GSTT1(-)組中精漿NO及精子DNA中8-OH-dG水平分別顯著高于GSTM1(+)及GSTT1(+)組(P<0.01)，而GSTM1/GSTT1(-/-)組精漿MDA、NO及精子DNA中8-OH-dG水平高于GSTM1/GSTT1(+/+)組(P<0.05)，而精漿T-AOC低于GSTM1/GSTT1(+/+)組(P<0.05)，這就表明GSTT1(+)及GSTM1(+)患者精液氧化應(yīng)激水平較GSTT1(-)及GSTM1(-)患者處于相對低水平。GSTP1(A/G+G/G)組中NO及精子DNA中8-OH-dG高于GSTP1(A/A)組(P<0.05)，而精漿T-AOC水平顯著低于GSTP1(A/A)組(P<0.01)，意味著基因型為GSTP1(A/G)和GSTP1(G/G)的患者比基因型為GSTP1(A/A)的患者精液氧化應(yīng)激水平更高。

綜上所述，GSTs基因多態(tài)性可以影響特發(fā)性男性不育患者精漿氧化水平和精子DNA氧化損傷。由于引起特發(fā)性男性不育的機(jī)制較為復(fù)雜，同時(shí)影響機(jī)體氧化應(yīng)激水平的因素有很多，本研究的樣本量較少，且存在地域局限性，有待大樣本、多中心進(jìn)一步研究。