韓 宇,程雨薇,沈敏熙,朱振宇,程 超,方維明,尹永祺

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127)

近年來,富含異硫氰酸酯(Isothiocyanates,ITCs)的功能性食品日益受到關(guān)注。ITCs是蔬菜中硫代葡萄糖苷(Glucosinolates,簡稱硫苷)在黑芥子酶(Myrosinase,MYR,EC 3.2.1.147)作用下形成的水解產(chǎn)物[1],對(duì)人體具有抗氧化和抗癌等多種生理功效[2]。ITCs已被證實(shí)是抗癌作用最強(qiáng)的天然植物活性成分,其可通過抑制階段I酶和激活階段II酶來發(fā)揮其抗癌功能[3-4]。流行病學(xué)研究顯示,食用西蘭花等蕓薹屬蔬菜可預(yù)防胰腺癌、肺癌和直腸癌等多種癌癥的發(fā)生,這主要與硫苷的水解產(chǎn)物ITCs有關(guān)[5]。

植物籽粒發(fā)芽尤其是逆境脅迫條件下發(fā)芽后其硫苷含量顯著增加,內(nèi)源黑芥子酶被激活,因此,通過控制發(fā)芽條件以富集芽苗中ITCs已成為一種行之有效的方法。研究發(fā)現(xiàn),植物發(fā)芽期間經(jīng)鹽脅迫[6]、硫酸鋅脅迫[7]、低氧脅迫[8]以及脫落酸處理[9],其芽苗中ITCs含量顯著提高。硒和硫?yàn)橥逶?其在原子大小、化學(xué)性質(zhì)方面相似,新陳代謝中硒可以替代硫起作用,以非特異性的方式取代硫。研究顯示亞硒酸鈉(Na2SeO3)處理可以提高芽苗中硫苷的含量[10-12]。同時(shí),甘藍(lán)根經(jīng)鹽脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理均可促進(jìn)ITCs富集[13]。然而,高溫脅迫尤其是高溫聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)于芽苗生理及ITCs代謝的影響未見報(bào)道。由于硫苷是防癌物質(zhì)的前體,與硒交換硫可能進(jìn)一步提高硫代葡萄糖苷水解產(chǎn)物的生物活性,因此研究硒對(duì)硫苷的富集具有重要意義。

本研究以西蘭花為試材,研究高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理下芽苗主要生理生化和ITCs代謝的變化,以期初步揭示高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理調(diào)控ITCs代謝的作用機(jī)制,為開發(fā)富含ITCs芽類營養(yǎng)食品提供技術(shù)支撐和理論依據(jù),推動(dòng)芽苗菜的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花種子(BrassicaoleraceaL.,優(yōu)秀) 購于2018年,產(chǎn)自日本坂田公司,封裝于密閉容器中,4 ℃保存?zhèn)溆?亞硒酸鈉、烯丙基硫苷(純度>95%)、蘿卜硫素(純度>99%)生化試劑 均為美國Sigma公司;1,2-苯二硫醇(純度>99%) 生化試劑,東京化成工業(yè)株式會(huì)社;其余試劑均為國產(chǎn)分析純;過氧化氫試劑盒A064、總抗氧化能力檢測試劑盒A015-1、葡萄糖測定試劑盒 為南京建成生物工程研究所。

pGX-150型智能光照培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠;UV-7504C型紫外可見分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司;DK-S12型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DICO型臺(tái)式離心機(jī) Thermo Fisher有限公司;XW-80C型漩渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞硒酸鈉濃度篩選 稱取西蘭花種子12 g,置于100 mL 1%(v/v)NaClO水溶液中20 ℃浸泡消毒15 min,消毒種子用蒸餾水沖洗至pH中性后于蒸餾水中30 ℃浸泡4 h,其后置于鋪有蛭石的透明盒中,于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽,16 h光照/8 h黑暗,分別用20 mL的0、10、50、100、200 μmol/L的Na2SeO3溶液噴施,發(fā)芽4 d后,測定各處理組西蘭花芽苗中異硫氰酸酯含量。

1.2.2 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理試驗(yàn) 按1.2.1中發(fā)芽方法,分別設(shè)以下處理:對(duì)照處理(蒸餾水)、高溫處理(60 ℃熱激20 min)、高溫聯(lián)合Na2SeO3處理(60 ℃熱激20 min,0.1 mmol/L Na2SeO3)。芽苗共發(fā)芽6 d,第1 d均噴施20 mL去離子水催芽,之后每隔24 h將熱激組芽苗置于60 ℃恒溫箱熱激處理20 min[14-15]并對(duì)不同處理組分別噴施20 mL不同處理液至培養(yǎng)結(jié)束,發(fā)芽期間4、6 d取樣測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)測定與方法

1.2.3.1 形態(tài)特征 從各處理組中隨機(jī)選取10株西蘭花芽苗,擺放整齊后,觀察其形態(tài)特征。

1.2.3.2 芽長及鮮重 隨機(jī)選取30株西蘭花芽苗,用游標(biāo)卡尺測定其芽長,并用精密電子天平進(jìn)行鮮重的測定,計(jì)算單株芽苗鮮重。

1.2.3.3 過氧化氫、丙二醛含量及總抗氧化能力的測定 過氧化氫含量利用過氧化氫試劑盒測定;參照硫代巴比妥酸法[16]測定丙二醛含量;總抗氧化能力(T-AOC)利用試劑盒測定。

1.2.3.4 ITCs、硫苷含量測定 參照J(rèn)iao等[17]的方法并修改。準(zhǔn)確稱取0.2 g芽苗,加入3 mL蒸餾水研磨,勻漿液于40 ℃水浴3 h后加入3 mL二氯甲烷振蕩萃取30 min,10000×g離心15 min,取下清液100 μL依次加入2 mL甲醇、1.8 mL 50 mmol/L硼酸緩沖液和0.2 mL 7 mmol/L 1,2-苯二硫醇的甲醇溶液,混合后置于65 ℃水浴1 h后于365 nm處測定吸光值。用蘿卜硫素作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品ITCs含量。硫苷含量參照Wei等[18]的方法測定。

1.2.3.5 黑介子酶活性 參照Burow等[19]的方法。取0.2 g芽苗,用3 mL 0.1 mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液冰浴研磨,4 ℃下10000×g離心15 min。取上清液0.5 mL與0.5 mL 0.25 mmol/L烯丙基硫苷溶液混合,于37 ℃水浴反應(yīng)15 min后沸水浴5 min以滅酶,用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量。以每分鐘被黑芥子酶轉(zhuǎn)化生成1 nmol葡萄糖為1個(gè)酶活力單位(U/mg protein)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,均值間比較采用Tukey多重比較,在0.05水平上進(jìn)行顯著檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉濃度篩選

如圖1所示亞硒酸鈉濃度為100 μmol/L時(shí)西蘭花芽苗中異硫氰酸酯含量顯著高于其他濃度處理(P<0.05),故本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mmol/L亞硒酸鈉溶液作為處理液。

圖1 不同濃度亞硒酸鈉對(duì)西蘭花芽苗中異硫氰酸酯含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Na2SeO3on the content of isothiocyanate in broccoli sprouts

2.2 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗生理代謝的影響

2.2.1 形態(tài)特征 圖2直觀顯示西蘭花芽苗經(jīng)高溫脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理后,其生長狀態(tài)均受到影響,且經(jīng)高溫脅迫聯(lián)合Na2SeO3處理的西蘭花芽苗受脅迫情況更嚴(yán)重,相較于對(duì)照,其芽苗及葉片的大小均明顯受到抑制。

圖2 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗形態(tài)表征的影響Fig.2 Effects of high temperature and its combinedwith Na2SeO3 on morphology of broccoli sprouts注:W:蒸餾水(空白對(duì)照);H:高溫;H-Se:高溫+Na2SeO3,圖3～圖9同。

2.2.2 芽長及鮮重 由圖3可看出,發(fā)芽期間各處理下的西蘭花芽苗芽長及鮮重均隨發(fā)芽時(shí)間延長呈增長趨勢,發(fā)芽4 d時(shí),各處理間芽長均具有顯著差異(P<0.05,圖3A),熱激處理下鮮重顯著低于對(duì)照處理(P<0.05,圖3B)。發(fā)芽6 d時(shí),高溫脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗芽長均顯著低于對(duì)照處理(P<0.05)。高溫脅迫聯(lián)合Na2SeO3處理發(fā)芽4、6 d時(shí)芽長分別為對(duì)照的79%和57%;發(fā)芽6 d時(shí),高溫脅迫聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗芽長及鮮重與高溫脅迫處理的無顯著差異(P>0.05),但高溫脅迫聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗鮮重顯著低于對(duì)照處理(P<0.05),表明高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理均顯著抑制了西蘭花芽苗的生長。

圖3 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗芽長(A)及鮮重(B)的影響Fig.3 Effects of high temperature and its combined treatmentwith Na2SeO3 on the sprout length(A)and fresh weight(B)of broccoli sprouts注:不同字母表示不同處理間芽苗的芽長及鮮重顯著差異,P<0.05;圖4～圖9同。

2.2.3 過氧化氫含量 如圖4,發(fā)芽期間各處理下西蘭花芽苗中過氧化氫含量均隨發(fā)芽時(shí)間延長呈下降趨勢。發(fā)芽4 d時(shí),相較對(duì)照處理,高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中過氧化氫含量均無顯著差異(P>0.05);發(fā)芽6 d時(shí),高溫脅迫聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中過氧化氫含量較空白對(duì)照顯著提高(P<0.05),其含量較空白對(duì)照提高了57%,而高溫脅迫處理與空白對(duì)照處理無顯著差異(P>0.05)。

圖4 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗過氧化氫含量的影響Fig.4 Effects of high temperature and its combined treatmentwith Na2SeO3 on hydrogen peroxide content in broccoli sprouts

2.2.4 丙二醛含量 植物器官衰老或在逆境下遭受傷害,往往發(fā)生膜脂過氧化作用,丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物,其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度,同時(shí),它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷,間接地反映了植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱[16]。如圖5,發(fā)芽期間各處理下西蘭花芽苗中丙二醛含量均隨發(fā)芽時(shí)間延長呈下降趨勢。發(fā)芽4 d,較對(duì)照而言,高溫脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中丙二醛含量均顯著增加(P<0.05),發(fā)芽6 d時(shí),高溫脅迫與高溫聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中丙二醛含量無顯著差異(P>0.05),但仍均顯著高于空白對(duì)照(P<0.05),表明芽苗經(jīng)高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理后其生長受到了抑制。

圖5 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗丙二醛含量的影響Fig.5 Effects of high temperature and its combined treatmentwith Na2SeO3 on malondialdehyde content in broccoli sprouts

2.2.5 總抗氧化能力 如圖6,發(fā)芽期間各處理下西蘭花芽苗中總抗氧化能力均隨發(fā)芽時(shí)間延長呈下降趨勢。發(fā)芽4、6 d時(shí),高溫脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中總抗氧化能力均較空白對(duì)照顯著提高(P<0.05),4 d時(shí)其總抗氧化能力較空白對(duì)照分別提高了29%和57%,而6 d時(shí)則較空白對(duì)照分別提高了25%和45%;發(fā)芽4、6 d時(shí),高溫脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中總抗氧化能力無顯著差異(P>0.05)。

圖6 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗總抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of high temperature and its combined treatmentwith Na2SeO3 on total antioxidant capacity of broccoli sprouts

2.3 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗異硫氰酸酯代謝指標(biāo)的影響

2.3.1 ITCs含量 發(fā)芽期間各處理下西蘭花芽苗中ITCs含量均隨發(fā)芽時(shí)間延長呈下降趨勢,見圖7。發(fā)芽4、6 d時(shí),高溫脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中ITCs含量較對(duì)照處理均顯著提高(P<0.05),發(fā)芽4 d時(shí),其ITCs含量分別是空白對(duì)照的2.36倍和3.35倍。同時(shí),相較于單獨(dú)高溫脅迫處理,高溫聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中ITCs含量也顯著提高(P<0.05)。發(fā)芽6 d時(shí),高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理的芽苗中ITCs含量分別是對(duì)照的2.1倍和2.46倍。研究結(jié)果表明,發(fā)芽4、6 d時(shí),西蘭花芽苗經(jīng)高溫及高溫聯(lián)合Na2SeO3處理均較空白對(duì)照可積累ITCs含量,且高溫聯(lián)合Na2SeO3處理4 d時(shí),芽苗中ITCs含量最高達(dá)267 mg/100 g FW。

圖7 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗異硫氰酸酯含量的影響Fig.7 Effects of high temperature and its combined treatmentwith Na2SeO3 on the content of isothiocyanate in broccoli sprouts

2.3.2 硫苷含量 如圖8,各處理下西蘭花芽苗中硫苷含量均隨發(fā)芽時(shí)間顯著降低(P<0.05)。發(fā)芽4 d時(shí),對(duì)照和高溫脅迫處理的芽苗中硫苷含量無顯著變化(P>0.05),而高溫聯(lián)合Na2SeO3處理顯著提高硫苷含量(P<0.05)。西蘭花芽苗經(jīng)高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理6 d,各處理硫苷含量無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果顯示西蘭花芽苗經(jīng)高溫聯(lián)合Na2SeO3處理發(fā)芽4 d時(shí)效果最好,其芽苗中ITCs含量和硫苷含量均最高。

圖8 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗硫苷含量的影響Fig.8 Effects of high temperature and its combined treatmentwith Na2SeO3 on glucosinolate content in broccoli sprouts

2.3.3 黑介子酶活性 由圖9可看出,西蘭花經(jīng)高溫聯(lián)合Na2SeO3處理期間,其芽苗中MYR活性與對(duì)照無顯著差異(P>0.05)。而高溫脅迫處理下西蘭花芽苗中MYR活性均顯著低于對(duì)照處理(P<0.05);發(fā)芽4 d時(shí),高溫聯(lián)合Na2SeO3處理的西蘭花芽苗中MYR活性較高溫脅迫處理無顯著變化(P>0.05),而發(fā)芽6 d時(shí),其MYR活性顯著提高(P<0.05),說明高溫聯(lián)合Na2SeO3處理后對(duì)西蘭花芽苗中MYR活性無顯著影響。

圖9 高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理對(duì)西蘭花芽苗黑介子酶活性的影響Fig.9 Effects of high temperature and its combined treatmentwith Na2SeO3 on the activity of myrosinase in broccoli sprouts

3 討論

植物在高溫、低氧、鹽害等逆境條件下,其生物膜受到損傷,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡失調(diào),進(jìn)而影響其蛋白質(zhì)等生物大分子正常代謝,植物的生長和發(fā)育受到抑制。一般陸生高等植物熱害界限溫度為35 ℃,本研究中,西蘭花發(fā)芽期間經(jīng)高溫(60 ℃)及其聯(lián)合Na2SeO3處理后,其生命活力受到脅迫抑制,相較正常生長芽苗,脅迫處理下的植株形態(tài)較小,芽長顯著降低。非生物脅迫下,植物體內(nèi)積累ROS是一種普遍現(xiàn)象,其對(duì)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)造成氧化傷害[20]。MDA 是細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物,其含量反映逆境下植物細(xì)胞的完整性[21]。西蘭花芽苗經(jīng)高溫聯(lián)合Na2SeO3處理,芽苗中 MDA和H2O2含量較對(duì)照均顯著增加(P<0.05),表明高溫聯(lián)合Na2SeO3處理致使西蘭花芽苗中活性氧累積,細(xì)胞膜脂過氧化嚴(yán)重。Peas等[22]發(fā)現(xiàn)適宜濃度硒處理可提高西蘭花芽苗抗氧化能力,而Yang等[23]研究顯示60 ℃熱激時(shí)甘藍(lán)的抗氧化能力達(dá)到最高,本研究同樣發(fā)現(xiàn)西蘭花芽苗經(jīng)高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理后,發(fā)芽4 d時(shí)其總抗氧化能力較對(duì)照均顯著提高,且其總抗能力高于發(fā)芽6 d。

非生物脅迫,如干旱、鹽害和低溫等均能夠引起植物損傷,并誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的增加[24]。ITCs作為植物中具有抗癌活性的次生代謝產(chǎn)物而一直受到食品科研工作者的關(guān)注。本研究結(jié)果顯示,西蘭花發(fā)芽期間經(jīng)高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理,發(fā)芽4 d和6 d時(shí)其ITCs含量均較對(duì)照處理顯著提高,同時(shí),高溫聯(lián)合Na2SeO3處理顯著高于單獨(dú)高溫脅迫處理。Kim等[13]研究也表明利用Na2SeO3對(duì)鹽脅迫下的甘藍(lán)進(jìn)行處理可有效提高其ITCs含量,這表明Na2SeO3聯(lián)合非生物脅迫(高溫脅迫和鹽脅迫)具有單獨(dú)環(huán)境脅迫的疊加作用,西蘭花芽苗經(jīng)高溫聯(lián)合Na2SeO3處理是富集ITCs的有效方式。ITCs的前體物質(zhì)硫苷在不同處理下其含量同樣發(fā)生顯著變化,高溫聯(lián)合Na2SeO3處理4 d時(shí),芽苗中硫苷含量較空白對(duì)照與高溫脅迫處理均顯著提高,而對(duì)照與高溫脅迫處理則無顯著差異,說明Na2SeO3處理顯著提高芽苗中硫苷含量,然而隨發(fā)芽時(shí)間延長,發(fā)芽6 d時(shí)西蘭花芽苗中硫苷含量顯著降低,且各處理間無顯著差異,這與vila等[25]的研究結(jié)果相一致。MYR作為水解硫苷產(chǎn)生ITCs的關(guān)鍵酶,本研究中高溫聯(lián)合Na2SeO3處理發(fā)芽期間,西蘭花芽苗中MYR活性均與對(duì)照處理無顯著差異,且單獨(dú)高溫脅迫處理時(shí)其MYR活性顯著低于對(duì)照處理。同樣的,NaCl和CaCl2處理對(duì)西蘭花芽苗中黑介子酶活性亦無顯著影響[26]。我們推測高溫及其聯(lián)合Na2SeO3處理提高ITCs含量可能并非通過直接提高M(jìn)YR活性達(dá)成,其可能與MYR以及ITCs合成途徑中其他關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān),這有待后續(xù)深入研究高溫及其Na2SeO3處理下西蘭花芽苗中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。

4 結(jié)論

西蘭花芽苗發(fā)芽期間經(jīng)高溫脅迫及其聯(lián)合Na2SeO3處理,其生長發(fā)育受到抑制,芽長顯著降低,丙二醛含量顯著增加,芽苗總抗氧化能力也顯著增加。高溫聯(lián)合Na2SeO3處理下芽苗中ITCs含量及硫苷含量顯著提高,高溫處理下MYR活性顯著降低。西蘭花芽苗經(jīng)高溫聯(lián)合Na2SeO3處理4 d,其ITCs和硫苷含量最高,表明高溫聯(lián)合Na2SeO3處理是富集西蘭花芽苗中ITCs和硫苷的有效方式,且發(fā)芽時(shí)間以4 d為宜。