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(1.山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南 250101;2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100176)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類廣泛存在的致癌、致畸、致突變的環(huán)境污染物,包含兩個或兩個以上的苯環(huán),主要來源于有機物的不完全燃燒[1-2]?？諝庵械腜AHs主要通過呼吸道進入人體,而水體、食品中的PAHs則通過飲食進入人體[3-4]。PAHs具有親脂性的特點,在食用油、熏燒烤肉及水產(chǎn)品等食品中均有檢出。苯并[a]蒽(BaA)、(CHR)、苯并[b]熒蒽(BbF)和苯并[a]芘(BaP)是毒性較強的4種PAHs[5-6],其中BaP被國際癌癥研究機構(gòu)歸為1類致癌物,其余三種歸為2B類致癌物[7]。因此,國內(nèi)和國際上對PAHs規(guī)定了限量要求。我國《食品安全安全國家標準 食品中污染物限量》(GB 2762-2017)中規(guī)定了谷物及其制品、熏燒烤肉類和熏烤水產(chǎn)品中BaP的限量為5.0 μg/kg,油脂及其制品中BaP的限量為10 μg/kg。2015年歐盟委員會規(guī)定出口歐盟的部分食品中4種PAHs的總量不得超過50 μg/kg[8]。因此,建立能夠快速同時測定4種PAHs含量的方法具有重要意義。

目前報道的PAHs的檢測方法主要有高效液相色譜法[9-13]和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[14-17]。高效液相色譜-熒光檢測法靈敏度高,穩(wěn)定性好,但是對樣品的凈化效果要求比較高。食品基質(zhì)比較復(fù)雜,易受雜質(zhì)干擾,因此必須對樣品進行前處理。常見的前處理方法主要有索式提取法[18]、液-液萃取法[9]、超聲提取法[19]、固相萃取法[11-12]和凝膠滲透色譜[20]。其中,固相萃取法由于簡單、節(jié)約溶劑、重現(xiàn)性好得到廣泛的應(yīng)用。

油炸型膨化食品由于食用方便、香酥可口、口味多樣受到眾多消費者的歡迎,其主要成分包括碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等。因膨化食品屬于高油脂、高熱量的食品,而多環(huán)芳烴屬于環(huán)境污染物,具有親脂性的特點,有可能會遷移到食品中。油炸型膨化食品在加工過程中會有煎炸工藝,有研究[21]表明油脂煎炸過程中會引起多環(huán)芳烴的變化,因此,2017年國家食品藥品監(jiān)管總局將油炸型膨化食品中BaA、CHR、BbF和BaP列入食品安全風險監(jiān)測計劃。目前對膨化食品中多環(huán)芳烴的檢測少有報道。

本文采用高效液相色譜法,系統(tǒng)考察了提取方式、提取溶劑種類、提取次數(shù)、凈化方式等對油炸型膨化食品中BaA、CHR、BbF、BaP提取和分離的影響,并考察了流動相及色譜柱種類對分離的影響,以期建立油炸型膨化食品中4種多環(huán)芳烴的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、正己烷、二氯甲烷 色譜純,德國Merck公司;乙醚、石油醚、氯化鈉 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;標準品(純度99.9%,濃度100 mg/L)、苯并[a]蒽(純度99.0%,濃度100 mg/L)、苯并[b]熒蒽(純度99.1%,濃度100 mg/L)、苯并[a]芘(純度99.5%,濃度100 mg/L) 美國o2si公司;Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg/6 mL) 艾杰爾;色譜柱PAH C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國Waters公司;實驗用膨化食品(薯片、蝦條、鍋巴) 購自濟南市當?shù)爻小?/p>

Waters 2695型高效液相色譜儀(配備2475熒光檢測器) 美國Waters公司;3-18K臺式高速離心機 德國Sigma公司;BT 125D電子天平 德國Sartorius公司;MS3型旋渦混合器 德國IKA公司;SB-800DTD超聲清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;HGC-24型氮吹儀 恒奧科技有限公司;GM-300型粉碎機 德國萊馳公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確移取4種多環(huán)芳烴標準溶液各0.1 mL于同一10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成濃度為1 mg/L的多環(huán)芳烴混合標準溶液。根據(jù)實際需要移取適量的混合標準溶液液用乙腈進行稀釋,得到濃度分別為0.5、1、4、20、40 μg/L的系列標準工作溶液。

1.2.2 樣品制備 將實驗所用薯片、蝦條、鍋巴分別于粉碎機中以10000 r/min轉(zhuǎn)速下粉碎,充分混勻,儲存于潔凈的容器中,4 ℃保存。

1.2.3 樣品前處理 提取:準確稱取1.2.2中制備的樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管A中,加入5 mL飽和氯化鈉溶液分散均勻,再加入10 mL正己烷,渦旋混合3 min,40 kHz頻率下常溫超聲提取15 min,室溫下8000 r/min離心5 min,取上層正己烷層于50 mL具塞離心管B中,離心管A中的溶液用10 mL正己烷重復(fù)提取一次,正己烷層合并于50 mL離心管B中,取10 mL于15 mL離心管中,作為待凈化液。凈化:依次用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化BAP-3固相萃取柱,將待凈化液全部轉(zhuǎn)移至SPE柱,5 mL正己烷淋洗,7 mL二氯甲烷洗脫,40 ℃下將洗脫液氮吹濃縮至干,最后用1 mL乙腈復(fù)溶,過0.22 μm有機濾膜,待HPLC-FLD檢測。同時做試劑空白實驗。

1.2.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

1.2.4.1 提取方式的選擇 考察了索式提取、超聲提取和液液萃取-超聲提取三種提取方式對目標物的提取效率。

索式提取:稱取1.2.2中制備的樣品2 g于索式提取器中,加入120 mL乙醚/石油醚混合液(體積比1∶1),連續(xù)提取4 h,經(jīng)濃縮后,用5 mL正己烷復(fù)溶,作為待凈化液。凈化方法同1.2.3中的凈化方法。

超聲提取:除不加飽和氯化鈉溶液外,其余步驟同1.2.3。

液液萃取-超聲提取:步驟同1.2.3。

1.2.4.2 提取溶劑種類的選擇 根據(jù)多環(huán)芳烴親脂性特點,本研究考察了正己烷、乙醚、乙腈三種提取溶劑目標物的提取效率,其它步驟和條件同1.2.3。

1.2.4.3 提取次數(shù)的優(yōu)化 考察了正己烷為萃取溶劑,對樣品分別提取1、2、3次時,4種多環(huán)芳烴的回收率,其它步驟和條件同1.2.3。

1.2.4.4 凈化條件的選擇 考察了中性Al2O3柱(22 g/60 mL,艾杰爾)、Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg/6 mL,艾杰爾)和Florisil固相萃取柱(500 mg/3 mL,艾杰爾)對樣品的凈化效果。樣品提取步驟和條件同1.2.3。

1.2.5 液相色譜條件 色譜柱:Waters PAH C18反相鍵合固定相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;進樣量20 μL;流速:1.5 mL/min;流動相:乙腈和水;檢測器:熒光檢測器,檢測波長見表1;梯度洗脫程序見表2。

表1 4種多環(huán)芳烴的熒光檢測參數(shù)Table 1 Fluorescence detection program of 4 PAHs

表2 HPLC梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for HPLC separation

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的Empower 3色譜數(shù)據(jù)處理軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理,以及Microsoft Excel進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化分析

2.1.1 提取條件的選擇

2.1.1.1 提取方式 針對食品基質(zhì)中PAHs的提取方式主要有液液萃取(Liquid-liquid Extraction,LLE)[9]、索式提取(Soxhlet Extraction,SE)[18]和超聲萃取(Ultrasonic Extraction,UE)[19]和超臨界流體萃取(Supercritical Fluid Extraction,SFE)[22]。實驗中考察了SE、UE、LLE-UE三種萃取方式對加標量為25 μg/kg的薯片樣品中4種PAHs提取效率的影響(見圖1)。結(jié)果表明,以上三種提取方式的回收率均在80%以上,滿足實驗要求,但SE耗時、溶劑消耗量大,因此不是資源節(jié)約、環(huán)境友好型方法的首選。LLE-UE相對于UE多了液液萃取步驟,能更好地分散樣品,起到一定程度的除雜效果,綜合考慮選擇LLE-UE作為樣品萃取處理方式。

圖1 提取方式對4種PAHs回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction methodson the recoveries of the four kinds of PAHs

2.1.1.2 提取溶劑種類 本研究比較了正己烷、乙醚、乙腈三種提取溶劑對薯片中4種PAHs提取效率的影響(見圖2)。乙醚和正己烷的提取效率相當,乙腈的提取效率稍低,這主要歸因于物質(zhì)間的相似相溶原理。PAHs組分為非極性或弱極性物質(zhì),分散到溶液中的PAHs更容易被弱極性的乙醚或正己烷萃取出來。乙醚屬于易制毒試劑且極易揮發(fā),正己烷屬于低毒試劑,因此選擇正己烷為提取溶劑。本實驗同時考察了水和飽和氯化鈉溶液分別作為分散劑時對目標物回收率的影響。實驗發(fā)現(xiàn)以水為分散劑時,用正己烷萃取易產(chǎn)生乳化層,導(dǎo)致回收率偏低;以飽和氯化鈉溶液為分散劑時可避免乳化層的產(chǎn)生。因此,本實驗選擇了飽和氯化鈉溶液為分散劑。

圖2 提取溶劑對4種PAHs回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solventson the recoveries of the four kinds of PAHs

2.1.1.3 提取次數(shù) 提取次數(shù)對4種PAHs回收率的影響見圖3。對樣品只提取1次,各目標物的回收率在71.0%～76.7%之間;提取2次,回收率在90.6%～96.2%之間;之后再增加提取次數(shù),回收率沒有明顯增加,因此,選擇提取次數(shù)為2次。

圖3 提取次數(shù)對4種PAHs回收率的影響Fig.3 Effects of different extraction numberson the recoveries of the four kinds of PAHs

2.1.2 凈化條件的選擇 油炸型膨化食品基質(zhì)比較復(fù)雜,含有大量的油脂等干擾物,而目標物含量較低,因此需要在前處理過程中對目標物進行凈化和富集。文獻報道的常見的凈化方式有皂化反應(yīng)[13]、凝膠滲透色譜[20]和固相萃取[11-12]等。皂化反應(yīng)往往需要較高的溫度和長時間的反應(yīng),且皂化后需要進一步富集;凝膠滲透色譜法儀器成本高,且溶劑使用量大。固相萃取由于簡單、快速、節(jié)約溶劑等特點被廣泛應(yīng)用于PAHs的凈化。

表3 3種小柱凈化樣品的條件及4種PAHs的回收率Table 3 SPE conditions and recoveries of four PAHs in samples

本實驗考察了中性Al2O3柱(22 g/60 mL,艾杰爾)、Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg/6 mL,艾杰爾)和Florisil固相萃取柱(500 mg/3 mL,艾杰爾)對薯片樣品的凈化效果。3種小柱的凈化方法及化合物的回收率見表3,凈化后的色譜圖見圖4。結(jié)果表明,樣品經(jīng)過三種固相萃取柱凈化后,回收率無明顯差異,但是經(jīng)過中性氧化鋁柱和弗羅里硅土柱凈化后,仍有雜質(zhì)峰影響的分離,而經(jīng)過BAP-3凈化后,雜質(zhì)峰消失。這主要是因為BAP-3固相萃取柱是苯并芘分子印跡柱,對結(jié)構(gòu)相近的、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘等重質(zhì)PAHs可以選擇性的保留。另外,中性氧化鋁柱需要80 mL洗脫溶劑,溶劑消耗量較大;弗羅里硅土柱需要在上樣時開始接液,氮吹時間較長。綜合考慮,選擇BAP-3固相萃取柱作為凈化柱。

表4 4種PAHs的回歸方程、線性范圍、r及LOQTable 4 Linear equations,linearity range,r and LOQ of 4 PAHs

圖4 加標樣品經(jīng)過凈化柱后的色譜圖Fig.4 Chromatograms of spiked samplesunder different clean-up condition注:A:Al2O3柱;B:Florisil柱;C:BAP-3;1:BaA;2:CHR;3:雜質(zhì)峰;4:BbF;5:BaP。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 BaA與CHR結(jié)構(gòu)相近,互為同分異構(gòu)體,分離較為困難。本實驗比較了Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)、Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Waters PAH C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)三種不同的色譜柱對目標物的分離效果。在Waters XBridge C18和Symmetry C18色譜柱上BAP與CHR完全重合,無法實現(xiàn)分離,而在Waters PAH C18柱上兩種組分可以得到完全分離,分離度為1.81(見圖5)。因此本實驗采用了Waters PAH C18色譜柱進行分離分析。

圖5 4種多環(huán)芳烴標準品的色譜圖Fig.5 The HPLC chromatogram of four standards of PAHs注:1:BaA;2:CHR;3:BbF;4:BaP。圖6同。

2.2.2 流動相與流速的選擇 本實驗考察了甲醇-水和乙腈-水分別作為流動相時對目標物的色譜保留行為的影響。當流動相為甲醇-水時峰形展寬,出峰時間較晚,分離度較差;而用乙腈-水為流動相時峰寬變窄,峰形變好,出峰時間適中,這主要歸因于反相色譜中乙腈的洗脫能力大于甲醇的洗脫能力。當流速為1.0 mL/min時,BAP的出峰時間在25 min之后,出峰時間較晚;當流速為2.0 mL/min時,柱壓升高,影響色譜柱的使用壽命,綜合考慮選擇1.5 mL/min的流速為本次實驗的最終流速。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系與檢出限 將濃度分別為0.5、1.0、4.0、20.0、40.0 μg/L的PAHs混合標準工作液注入液相色譜儀,按儀器設(shè)定的條件進行測定,以各物質(zhì)的峰面積(y,微伏*秒)為縱坐標,以質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標,繪制標準曲線,求得線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)(r)(見表4)。以10倍基線噪音確定方法的定量限(LOQ),方法的LOQ為0.3～0.5 μg/kg?？瞻资砥瑯悠泛图訕藰悠?1 μg/kg)譜圖見圖6。

表5 4種PAHs的回收率和精密度(n=6)Table 5 Recovery and relative standard deviation of 4 PAHs(n=6)

表6 本方法與GB 5009.265-2016在實際樣品檢測中獲得4 種PAHs結(jié)果的比較(n=6)Table 6 Comparison of results of 4 PAHs obtained by GB 5009.265-2016 and the method in this paper in actual sample

圖6 空白樣品(A)和加標樣品(B)的4種PAHs色譜圖Fig.6 Chromatograms showing the blank sample(A)and spiked sample(B)for four kinds of PAHs

2.3.2 回收率與精密度 向空白樣品中分別進行低(1 μg/kg)、中(5 μg/kg)、高(25 μg/kg)三水平的加標,每種加標樣品平行測定6份,考察方法的回收率與精密度。方法的平均回收率在90.3%～107.4%之間,精密度在6.5%以下,符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗》中檢驗方法確認對回收率和精密度的要求,具體數(shù)據(jù)見表5。

2.4 方法對比

將樣品按優(yōu)化好的方法進行測定,結(jié)果與現(xiàn)有標準GB 5009.265-2016高效液相色譜法測定PAHs的結(jié)果比較,如表6所示。GB 5009.265-2016高效液相色譜法對油脂含量較高的食品采用乙腈提取目標物,正己烷除脂后旋蒸濃縮,再過弗羅里硅土柱凈化,樣品處理復(fù)雜,效率低,不適用于大批量樣品的處理。本方法前處理步驟簡單,重現(xiàn)性好,適合BaA、CHR、BbF和BaP的檢測。

2.5 實際樣品分析

按照實驗選擇的最優(yōu)條件對濟南市各大超市采購的25批次油炸型膨化食品進行分析,檢測結(jié)果見表7。實際樣品中檢出的BaP的最高含量為3.1 μg/kg,4種PAHs含量之和最高為4.2 μg/kg。參照我國和歐盟的限量標準,膨化食品中的4種PAHs的含量均滿足限量要求。

表7 膨化食品中4種PAHs的含量Table 7 The test results of fourkinds of PAHs in expanded foods

注：ND:未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-熒光法測定油炸型膨化食品中4種多環(huán)芳烴的分析方法。通過提取條件和凈化條件的優(yōu)化,有效地去除了基質(zhì)干擾。通過色譜條件的優(yōu)化,實現(xiàn)了4種PAHs的基線分離,且方法的回收率和精密度均滿足GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗》中檢驗方法確認要求。該方法簡單、快速、準確度高、精密度好,可應(yīng)用于油炸型膨化食品中多環(huán)芳烴的日常分析檢測。