李文華，王君君，甘俊英，牛書彥，馬 秘，唐 萌，薛玉英

（東南大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京210009）

納米材料的三維結構中至少有一維尺寸在1～100 nm 范圍內，具有尺寸小、比表面積大和生物活性高等特性。其中，納米銀（silver nanoparticles，AgNP）具有抗細菌、抗病毒和抗寄生蟲等特性，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工等領域，是應用較為廣泛的納米顆粒[1-2]。人類可通過呼吸道、胃腸道、皮膚等多種途徑接觸到AgNP。已有研究表明，SD大鼠經口染毒后，AgNP可進入血液，并在體內廣泛分布，對多個器官、系統(tǒng)造成損害[3]，其毒性作用的強弱與其本身粒徑[4-5]和表面包被[6]等多種因素有關。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.ele?gans，簡稱線蟲）在遺傳、生理、分子和發(fā)育水平是最具特征性的模式動物之一，在毒理學研究中作為模式動物得到越來越廣泛的應用，如化學品毒性篩檢、納米材料、重金屬和農藥毒理學效應及機制研究等[7-10]。目前，關于AgNP 引起毒性的作用機制還不是十分清楚。有研究發(fā)現，AgNP 可穿透細胞膜，通過產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）造成氧化應激并破壞細胞成分[11-12]。本研究探討不同粒徑、不同包被的AgNP 對模式生物線蟲的壽命、頭部擺動頻率、身體彎曲頻率和體內氧化應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

20 nm 的AgNP（AgNP-20）和AgNP-50 粉體，上海允復納米科技有限公司；20 nm 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的AgNP（AgNP-PVP-20）粉體，上海滬正納米科技有限公司；羥丙甲纖維素，美國Sigma公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（KGT003-1），南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（S0052）和ROS檢測試劑盒（S0033），上海碧云天生物技術有限公司。

Zetasizer Nano-ZS90 型馬爾文粒徑分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；KQ-2200E 型超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；JEM-2100型透射電鏡，日本JEOL 公司；MVS-1 型渦旋混合器，北京金紫光科技發(fā)展有限公司；Tissuelyser-24 多樣組織研磨機，上海凈信科技公司；Nikon倒置熒光顯微鏡Ti-E，日本Nikon公司；EPOCH酶標儀，美國BIOTEK公司；SHP150生化培養(yǎng)箱，上海精宏試驗設備有限公司。

1.2 動物、分組和處理

野生型秀麗隱桿線蟲（N2，美國明尼蘇達大學線蟲遺傳中心），培養(yǎng)于含有大腸桿菌OP50的線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth media，NGM）上，20℃生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。3 種AgNP（AgNP-50，AgNP-20 和AgNP-PVP-20）各分為溶劑對照組（1%羥丙甲纖維素）和濃度為1，10 和100 mg·L-1的AgNP染毒組。染毒時，將染毒液超聲20 min分散均勻，取200 μL 均勻涂布于直徑3.5 cm 的NGM上，對照組加等體積溶劑，于20℃，30 min使染毒液滲入到培養(yǎng)基中，將同步化[13]至L1期線蟲轉移到不同濃度的染毒培養(yǎng)皿，于20℃暴露48 h。每個劑量組設置3個平行樣，每項實驗重復3次。

1.3 線蟲壽命觀察

染毒48 h 后挑取線蟲至新的涂有OP50 的NGM 上，NGM 加5-氟尿嘧啶0.4 ng·L-1抑制線蟲排卵，且不影響其壽命。每個培養(yǎng)皿挑取30 條線蟲，每2～3 d 更換培養(yǎng)基，每天記錄線蟲存活數目、丟失數目和死亡數目，直至線蟲全部死亡。用挑針輕觸線蟲，未有任何反應即為死亡。以染毒結束計為線蟲壽命的第1 天，以線蟲全部死亡的時間計為最長壽命，以線蟲死亡半數的時間計為平均壽命。存活率（%）=當天存活數/（線蟲總數-丟失數）×100%，相對平均壽命（%）=各劑量組平均壽命/溶劑對照組平均壽命×100%。

1.4 線蟲頭部擺動和身體彎曲次數觀察

染毒結束后，挑取1 條線蟲于新的未加OP50的培養(yǎng)基上靜置1 min，待其爬行恢復后，于顯微鏡下觀察并記錄20 s 內線蟲頭部擺動的次數或身體彎曲的次數。線蟲頭部從身體一側擺向另一側，且角度＞90°定義為一次頭部擺動；線蟲相對于身體長軸方向作一個正弦波移動定義為一次身體彎曲。每個劑量組計數30條線蟲。

1.5 DCFH-DA熒光探針檢測線蟲體內ROS含量

稱取氯化鈉2.5 g、磷酸氫二鈉3 g 和磷酸二氫鉀1.5 g，加蒸餾水定容到500 mL，高壓蒸汽滅菌后加入硫酸鎂1 mol·L-10.5 mL，搖勻，配制成M9 緩沖液。染毒結束后，將線蟲移至1.5 mL 離心管，用M9 緩沖液洗滌3 次，加入2 μL 用無水乙醇稀釋至0.2 mmol·L-1的DCFH-DA 探針，置于25℃生化培養(yǎng)箱內3 h，再用M9 緩沖液洗去線蟲體表的探針，轉移至瓊脂糖凝膠墊上，滴0.5 mol·L-1疊氮化鈉20 μL麻醉線蟲，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。用Image J 軟件進行熒光強度定量分析，反映線蟲體內ROS含量。

1.6 TBA法檢測線蟲體內MDA含量

將染毒結束的線蟲用M9清洗3次后棄上清，稱取線蟲質量并加入預冷的生理鹽水，制備成10%的組織勻漿液，于4℃，12 000×g 離心5 min，取上清液根據MDA檢測試劑盒步驟檢測MDA含量。

1.7 比色法檢測線蟲體內GSH含量

同1.6 制備10%組織勻漿液，取上清液，根據GSH檢測試劑盒步驟檢測GSH含量。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結果數據均以x±s表示，采用SPSS Statis?tics 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，多組比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組之間比較，若方差齊，采用LSD-t 檢驗方法；若方差不齊，則采用Dunnett T3 檢驗方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AgNP 染毒對線蟲存活率和相對平均壽命的影響

線蟲相對平均壽命結果（圖1A）顯示，與溶劑對照組相比，AgNP-50 的10 和100 mg·L-1組線蟲相對平均壽命分別降低15%和23%（P＜0.05），AgNP-20的10和100 mg·L-1組線蟲相對平均壽命分別降低16%和24%（P＜0.05），AgNP-PVP-20 的1～100 mg·L-1組線蟲相對平均壽命分別降低11%，18%和26%（P＜0.01）。

線蟲存活率結果（圖1B-D）顯示，溶劑對照組線蟲最長壽命為22 d，AgNP-20，AgNP-PVP-20 和AgNP-50的10～100 mg·L-1組線蟲存活率下降（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of silver nanoparticles（AgNPs）on sur?vival and relative mean lifespan（A）and survial rate（B-D）of Caenorhabditis elegans（C. elegans）.

2.2 AgNP染毒對線蟲頭部擺動和身體彎曲行為的影響

與溶劑對照組相比，3 種AgNP 10～100 mg·L-1組線蟲頭部擺動頻率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖2）；AgNP-PVP-20 各濃度組及AgNP-50 和AgNP-20 的100 mg·L-1組線蟲身體彎曲頻率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖3）。

Fig.2 Effects of AgNPs on number of head thrashes of C.elegans.

Fig.3 Effect of different AgNPs on numbers of body bends of C. elegans.

2.3 AgNP 染毒對線蟲體內ROS，MDA 和GSH 含量的影響

ROS 含量檢測結果顯示，與溶劑對照組比較，3種AgNP的1～100 mg·L-1組線蟲體內的熒光強度均隨著劑量的升高而呈現不同程度的升高，其中AgNP-PVP-20 的100 mg·L-1組線蟲的熒光強度最強，AgNP-50的1 mg·L-1組線蟲的熒光強度最弱。相對熒光強度結果顯示，與溶劑對照組比較，AgNP-50，AgNP-20 和AgNP-PVP-20 的1～100 mg·L-1組線蟲的相對熒光強度均升高（P＜0.01）（圖4）。

Fig.4 Effect of AgNPs on reactive oxygen species（ROS） in C. elegans.

與溶劑對照組相比，AgNP-PVP-20 10 和100 mg·L-1組線蟲體內MDA 含量升高（P＜0.05）、GSH含量下降（P＜0.05）。AgNP-20 100 mg·L-1組線蟲GSH含量下降（P＜0.05），AgNP-50 1～100 mg·L-1組線蟲體內MDA和GSH含量無明顯變化（表1）。

Tab.1 Effect of AgNPs on contents of malondialde?hyde（MDA）and glutathione（GSH）in C.elegans

3 討論

本研究結果顯示，3 種AgNP 會使線蟲存活率下降、相對平均壽命降低、頭部擺動和身體彎曲頻率下降、體內ROS含量增加；暴露濃度越高，毒性作用越明顯。AgNP-PVP-20 使線蟲體內MDA 和GSH 含量均發(fā)生改變，提示氧化應激可能是AgNP產生毒性作用的機制之一。

納米銀的毒性影響很多，主要有尺寸大小[15]、表面修飾[16]和形狀[17]等。Liu等[18]研究了不同尺寸（5，20和50 nm）的3種AgNP的細胞毒性，發(fā)現尺寸較小的比較大的更容易進入細胞，所有種類細胞毒性反應及EC50值均表現出尺寸依賴性。Ahamed等[16]研究了有無多糖包被的2 種AgNP 對2 種哺乳動物細胞——小鼠胚胎干細胞和小鼠胚胎成纖維細胞的DNA 損傷，結果表明，有多糖包被AgNP 的毒性大于無包被AgNP，原因可能是有包被AgNP 的分散性更好，易進入細胞，而未包被AgNP聚集現象比較嚴重，不容易進入細胞。Abramenko 等[17]的研究結果顯示，扁平AgNP的毒性比球形AgNP大。這些研究表明，尺寸越小、分散性越好的AgNP 毒性越大。本研究中，AgNP-20，AgNP-50和AgNP-PVP-20均為球形顆粒；透射電鏡結果顯示其粒徑大小分別為20.14，22.08和49.84 nm；AgNP-20和AgNP-50有聚集現象，AgNP-PVP-20 分散良好。本研究發(fā)現，3種納米銀中AgNP-PVP-20對線蟲影響最大，能顯著降低線蟲存活率、相對平均壽命、頭部擺動和身體彎曲頻率，提示AgNP-PVP-20的毒性最大。

氧化應激是納米銀的毒性機制之一，其主要是引起細胞內ROS含量的增加，進一步導致脂質過氧化反應，MDA是脂質過氧化反應的產物。通過檢測體內ROS和MDA的含量可間接反映機體氧化應激水平，ROS和MDA含量越高，表明氧化應激水平越高[19]。GSH是細胞內主要的抗氧化劑，通過清除自由基和過氧化氫來保護機體免受氧化應激引起的損害，機體GSH 含量降低，會使抗氧化能力下降[20]。McShan 等[11]的研究提示，納米銀可穿透細胞膜，產生過量ROS 引起氧化應激并破壞細胞成分，引起DNA 損傷、抗氧化酶激活、抗氧化劑（如GSH）消耗和損傷細胞膜，細胞成分的破壞會進一步使細胞功能受損。在一定范圍內，納米銀引起ROS過量產生，使細胞內抗氧化劑如SOD、過氧化氫酶、GSH等產生增加以對抗ROS的損傷作用，當細胞抗氧化作用不足以抵抗ROS的破壞作用時，抗氧化物質含量下降，細胞死亡。3 種AgNP 均引起線蟲體內ROS 含量升高，但AgNP-PVP-20 10～100 mg·L-1組線蟲體內MDA 含量均升高、GSH 含量均下降，而只有AgNP-20 100 mg·L-1組線蟲GSH含量下降，AgNP-50各劑量組MDA和GSH含量均無明顯改變，表明AgNP-PVP-20 引起的線蟲氧化應激毒性作用更大。

綜上所述，3 種AgNP 均不同程度地影響線蟲的壽命、頭部擺動頻率、身體彎曲頻率和氧化應激水平，毒性大小AgNP-PVP-20＞AgNP-20＞AgNP-50。造成這種毒性差異的原因可能是AgNP-PVP-20的尺寸較小，并且表面有PVP包被，分散性好，更容易進入細胞并誘導氧化應激，導致較強的毒性效應。提示表面包被在改善納米顆粒穩(wěn)定性的同時，可能會改變納米材料的生物效應，充分認識納米材料的理化性質有助于更好的理解其生物效應。對于不同尺寸和包被的納米銀的毒性作用機制尚需要深入探索，以期更加安全合理地應用納米銀。