余鴻強，尉杰忠

（1.山西中醫(yī)藥大學，山西 太原030619；2.中樞神經(jīng)炎癥變性疾病新藥創(chuàng)制省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西 大同037009）

伴隨全球人口老齡化，阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）的發(fā)病率和患病率迅速攀升，全球AD患者已超過3600 萬，2050 年將達到1.15 億[1]，AD的防治在我國也已成為備受關注的健康和社會問題。導致疾病產(chǎn)生的β 淀粉樣蛋白（amyloid-beta protein，Aβ）不正常的聚集和毒性作用阻礙了神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。小膠質(zhì)細胞具有吞噬作用，以清除生理狀態(tài)下死亡的細胞蛋白或清理疾病狀態(tài)下的病理產(chǎn)物。另一方面小膠質(zhì)細胞監(jiān)控腦內(nèi)的炎癥環(huán)境。大量具有毒性作用的Aβ 在腦內(nèi)聚集引起小膠質(zhì)細胞過度活化，導致神經(jīng)炎癥反應的發(fā)生，主要表現(xiàn)有一氧化氮（nitric oxide，NO）含量增高、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide syn?thase，iNOS）蛋白和mRNA 表達水平升高，以及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等表達水平升高。有研究表明，Aβ1-42寡聚體具有毒性作用并能夠刺激小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應[2-3]。小膠質(zhì)細胞可以通過細胞自噬降解細胞外的Aβ1-42蛋白并能調(diào)控NACHT，LRR和PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3（NACHT，LRR和PYD domains-containing protein 3，NLRP3）炎性小體[4]。因此，減少Aβ 的聚集對緩解AD 癥狀有一定的促進作用；同樣Aβ 聚集的減少能減緩小膠質(zhì)細胞對中樞神經(jīng)的損傷及減少神經(jīng)毒性和氧化損傷[5-6]。目前對小膠質(zhì)細胞功能及對疾病作用的認識并不深入，有藥物能夠暫時緩解AD的癥狀，但沒有尋找到藥物能夠有效治療AD。因此，研究安全有效的AD治療藥物及調(diào)控小膠質(zhì)細胞的炎性水平具有重大的臨床意義。

姜黃素（curcumin）是一種非極性多酚類化合物，具有抗炎作用，能夠降低NO含量、抑制iNOS蛋白和mRNA 的表達[7]，并可抑制炎癥因子TNF-α，IL-6和IL-1β的釋放[8]。姜黃素通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的小膠質(zhì)細胞激活[9]。也有研究表明，姜黃素能抑制磷酸化的c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路以阻礙蛋白翻譯過程，進而改善神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性病變導致的AD癥狀[10]。此外，姜黃素通過影響細胞自噬調(diào)控細胞凋亡過程及對凋亡產(chǎn)物的清理[11]，姜黃素也參與對活性氧（reactive oxygen species，ROS）的調(diào)控，從而減少其對細胞及組織的損傷[12]。有研究顯示，姜黃素在＜1 μmol·L-1能夠減少細胞內(nèi)ROS的含量，而在5～10 μmol·L-1主要參與細胞自噬過程，在約25 μmol·L-1時也調(diào)控細胞凋亡過程，＞25 μmol·L-1時，導致細胞死亡[13]。本研究利用Aβ1-42蛋白刺激小膠質(zhì)細胞誘導細胞炎癥模型，觀察姜黃素是否能抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥水平，并探討小膠質(zhì)細胞對Aβ1-42的吞噬能力，為臨床治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

0.05%胰酶和胎牛血清（以色列Biological Indus?tries公司）。青、鏈霉素（北京中生奧公司）。DMEM（美國Gibco 公司）。姜黃素和Aβ1-4（美國Sigma公司）。一抗：兔抗人微管相關蛋白1輕鏈3（micro?tubule-associated protein 1 light chain 3，LC-3）單抗和兔抗人iNOS 和自噬相關蛋白5（autophagyrelated protein 5，Atg5）單抗（美國Cell Signaling Technology 公司）；兔抗人P62 單抗（日本MBL 公司）；兔抗人Aβ單抗（美國Millipore公司）、小鼠抗人肌動蛋白單抗、小鼠抗人GAPDH 單抗和Hoch?est33258（康維公司）。二抗：辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG 和山羊抗小鼠IgG（上海GE Health?care Science 公司）。RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金公司）。QPCR 試劑盒（北京康為世紀公司）。PVDF 膜（美國Millipore 公司）。醫(yī)用X 射線膠片（上海Carestream 公司）。Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和Alexa Fluor 633（美國Invitrogen 公司）。細胞松弛素D（cytochalasin D，CytoD）（美國Life techonogies 公司）。BSA 法蛋白濃度測定試劑盒與抗熒光淬滅封片液（上海碧云天公司），ATP 檢測試劑盒（北京Promega 公司）。牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）（上海翊圣生物技術公司）。

正置熒光顯微鏡（上海Nikon 公司，型號eclipse Ti-U）。Milli-Q 純水儀（德國MeRck 公司，型號Milli-Q Biocel）。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司，型號MyCycler）。細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司，型號SeriesⅡWater lacke）。X 膠片洗片機（伊士曼Kodak 公司，型號Medical X-ray processor 102）。多功能酶標儀（瑞士Tecen公司，型號Infinite M200）。熒光定量PCR儀（美國Angilent Technologies 公司，型號Stratagene Mx3005P）。NanoDrop 分光光度計（上海Implen公司，型號Nanophotometer P330）。

1.2 Aβ1-42寡聚體的制備

用六氟異丙醇1 mL 溶解干粉狀Aβ1-42后以14 000×g真空離心4 h，揮發(fā)干燥后用1×PSB溶解Aβ1-42，分裝，-20℃保存。

1.3 動物、細胞和細胞培養(yǎng)

小鼠小膠質(zhì)細胞BV2 細胞來源于軍事科學院軍事醫(yī)學研究院袁增強課題組；出生24 h內(nèi)C57雄性小鼠，SPF 級，斯貝福公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2016-0002。

1.3.1原代小膠質(zhì)細胞分離和培養(yǎng)

用75%乙醇浸泡出生24 h內(nèi)的小鼠，于超凈臺下取出全腦，在體視顯微鏡下分離大腦皮質(zhì)和海馬，用剪子將組織剪碎，0.25%胰酶37℃水浴消化10 min；加入等體積含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基孵育2 min；用10 mL 吸管吹打細胞懸液10 次后750×g離心5 min去上清；用含2%青鏈霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，400目濾網(wǎng)過濾細胞后接種至多聚-L-鳥氨酸（poly-L-ornithine，PLO）包被過的細胞培養(yǎng)瓶，37℃溫箱培養(yǎng)；24 h 后更換培養(yǎng)基以除去死細胞，第9 天時收集細胞，用于原代小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ1-42實驗。

1.3.2 shRNA-慢病毒敲降自噬相關蛋白5 基因的BV2細胞的制備

制備病毒顆粒：用10 cm 的培養(yǎng)皿37℃，5%CO2，95%濕度培養(yǎng)HEK293T 細胞，待細胞密度約為1×108L-1時用于轉(zhuǎn)染；將攜帶目的基因Atg5 shRNA 序列的質(zhì)粒pLKO、攜帶巨細胞病毒啟動子的質(zhì)粒pCMV-ΔR8.91和含包膜蛋白的病毒包裝質(zhì)粒VSV-G/pMD 2G按照10∶9∶1的比例混勻后加入OPTI-MEM溶液中，靜置5 min后滴入HEK293T細胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染6 h后換成10%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收取細胞上清，經(jīng)0.45 um濾器過濾分裝，-80℃保存。

穩(wěn)定敲降Atg-5 的BV2 細胞篩選：未激活的BV2 細胞以密度4×108L-1接種在6 孔板中，每孔2 mL；培養(yǎng)12 h后每孔加入3 μL聚凝胺10 g·L-1和1 mL病毒上清，37℃繼續(xù)培養(yǎng)；6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，36 h 后細胞正常傳代，培養(yǎng)基中加入2 μL嘌呤霉素5 g·L-1；每12 h根據(jù)細胞死亡情況更換細胞培養(yǎng)基并加入嘌呤霉素；經(jīng)Western 印跡法篩選得到穩(wěn)定敲降Atg-5的BV2細胞。

1.4 MTT法檢測BV2細胞存活

將BV2細胞以4×1011L-1接種于96孔板中，8 h后加入不同濃度姜黃素（0.1，1，5，10，15，25 和40 μmol·L-1），混勻后37℃培養(yǎng)24 h，同時設立細胞和溶劑（DMSO，終濃度0.1%）對照組，每孔加MTT 5 g·L-1的溶液培養(yǎng)4 h，每組3復孔。待形成藍紫色結(jié)晶形成后每孔吸棄90 μL上清，每孔再加入150 μL DMSO；放置在搖床上振蕩10 min以使結(jié)晶完全溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀在492 nm 處檢測各孔吸光度值（A492nm）。細胞存活率（%）=藥物組A492nm/溶劑對照組A492nm×100%。

1.5 ATP法檢測BV2細胞存活

將BV2細胞以4×1011L-1接種于96孔板中，8 h后加入姜黃素（0.1，1，5，10，15，25和40 μmol·L-1），同時設立細胞和溶劑對照組，混勻后37℃培養(yǎng)24 h，每組3 復孔。吸走96 孔板中的培養(yǎng)基后每孔加入100 μL ATP 試 劑 混 合 液1 mg·L-1避 光 放 置

10 min，將上清液移入不透明的96 孔板中，用酶標儀檢測上清液A562nm。細胞存活率（%）=藥物組A562nm/溶劑對照組A562nm×100%。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測BV2細胞和原代小膠質(zhì)細胞中iNOS，IL-6 和TNF-α mRNA 表達水平

BV2 細胞和原代小膠質(zhì)細胞分別以4×1011L-1接種在12 孔板中，每孔1 mL，8 h 后加入姜黃素5和10 μmol·L-1，37℃培養(yǎng)2 h，分別向2種細胞中加入Aβ1-421 mg·L-1培養(yǎng)24 h，同時設立溶劑對照組。分別提取RNA，并測定其濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA 模板。使用實時定量PCR試劑盒定量檢測PCR，PCR反應條件：95℃10 min；95℃30 s，60℃45 s，40 個循環(huán)。以內(nèi)參基因為標準分析結(jié)果，用2-△△CT法定量mRNA 表達。引物序列見表1。

Tab1. Sequence of primers

1.7 Western 印跡法檢測BV2 細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、iNOS、Atg-5和P62蛋白表達水平

每孔1 mL 密度為4×1011L-1的BV2 細胞接種在12 孔板中，8 h 后加入不同濃度姜黃素（5 和10 μmol·L-1）混勻37℃培養(yǎng)2 h，向BV2 細胞的培養(yǎng)基中加入Aβ1-421 mg·L-1培養(yǎng)24 h，同時設立溶劑對照（DMSO）組。0.05%胰酶消化細胞，750×g離心3 min，BCA法檢測細胞蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)變性后進行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。加入iNOS，Atg-5，P62 和LC3 一抗（1∶1000），4℃過夜。加入二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，蛋白顯影后，用掃描儀掃描X光片。用目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值的比值表示目標蛋白相對表達水平。

1.8 Western印跡法檢測BV2細胞對Aβ1-42的吞噬

密度為4 × 1011L-1的BV2 細胞接種在12 孔板中，每孔1 mL，8 h后加入姜黃素5和10 μmol·L-1，混勻37℃培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)基中加入Aβ1-421 mg·L-1培養(yǎng)4 h，同時設立溶劑對照（DMSO）組。Aβ 一抗稀釋比例為1∶1000，蛋白電泳的方法同1.7。

1.9 Western 印跡法檢測原代小膠質(zhì)細胞對Aβ1-42的吞噬

向24 孔板中加入500 μL 1×Plo 包被玻片8 h，吸去1×Plo后用1×PBS清洗3次，將0.5 mL密度為4×108L-1原代小膠質(zhì)細胞接種在24孔板中，8 h后加入姜黃素5和10 μmol·L-1混勻，37℃培養(yǎng)24 h，加入Aβ1-421 mg·L-1培養(yǎng)4 h；用能通過抑制細胞肌動蛋白聚合以影響細胞吞噬能力的Cyto D（10 mmol·L-1）作陰性對照組[14-15]。Aβ1-42一抗稀釋比例為1∶1000，蛋白電泳及定量方法同1.7。

1.10 細胞免疫熒光染色法檢測原代小膠質(zhì)細胞對Aβ1-42的吞噬和Iba1蛋白表達水平

密度為2×108L-1原代小膠質(zhì)細胞接種在24孔板中，每孔0.5 mL，8 h 后加入姜黃素5 和10 μmol·L-1混勻，37℃培養(yǎng)24 h，加入Aβ1-42-FITC 1 mg·L-1培養(yǎng)4 h，并設立Cyto D 10 mmol·L-1陰性對照組，獨立重復3次實驗。去掉上清用PBS清洗后加入4%PFA 固 定20 min；PBS 清 洗 后 用0.3 mL10%Triton X-100、5 mL馬血清和95 mL 1×PBS的混合液室溫封閉1 h。用封閉液稀釋離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1），一抗稀釋比例為1∶400，PBS 清洗；室溫孵育二抗（1∶1000）2 h 后室溫孵育Hoechest33258（1∶5000）15 min；PBS 清洗后封片。熒光圖像采集，共聚焦顯微鏡采集明場（bright field，BF），波長488 nm和633 nm信號通路的圖像，明場圖像大體呈現(xiàn)細胞輪廓，波長488 nm和633 nm所采集的圖像，并用Image J軟件統(tǒng)計細胞熒光強度。

1.11 Western 印跡法檢測穩(wěn)定敲降Atg-5 的BV2細胞中iNOS，Atg-5，LC3-Ⅱ和P62蛋白表達

密度為4×1011L-1穩(wěn)定敲降Atg-5 的BV2 細胞和對照細胞接種在6孔板中，每孔2 mL，8 h后加入姜黃素5 和10 μmol·L-1混勻，37℃培養(yǎng)2 h，向穩(wěn)定敲降Atg-5 的BV2 細胞的培養(yǎng)基中加入Aβ1-421 mg·L-1培養(yǎng)24 h，同時設立溶劑對照（DMSO）組。iNOS，Atg-5，P62 和LC3 一抗稀釋比例為1∶1000，蛋白電泳及定量方法同1.7。

1.12 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用x±s表示，用Origin 8.0數(shù)據(jù)軟件進行Student t 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對BV2細胞存活的影響

MTT結(jié)果顯示（圖1A），與DMSO組相比，姜黃素40 μmol·L-1處理組細胞存活率為（54±7）%（P＜0.01），其他濃度組之間無顯著差異。ATP 結(jié)果顯示（圖1B），與DMSO 組相比，姜黃素40 μmol·L-1處理組細胞存活率為（30±9）%（P＜0.01）。姜黃素≤25 μmol·L-1時無明顯細胞毒性。

Fig.1 Effect of curcumin（Cur）on BV2 cell viability by MTT assay（A）and ATP assay（B）.

2.2 姜黃素對Aβ1-42誘導的BV2細胞iNOS，IL-6和TNF-α mRNA表達水平的影響

qPCR 結(jié)果顯示（表2），與DMSO 組相比，Aβ1-42組BV2 細胞內(nèi)iNOS，IL-6 和TNF-α mRNA水平升高（P＜0.01）；與Aβ1-42組相比，姜黃素5 和10 μmol·L-1組BV2 細胞內(nèi)iNOS，IL-6 和TNF-α mRNA水平明顯降低（P＜0.01）。

2.3 姜黃素對Aβ1-42誘導的原代小膠質(zhì)細胞iNOS和TNF-α mRNA表達水平的的影響

與DMSO 組相比，Aβ1-42組原代小膠質(zhì)細胞內(nèi)iNOS 和TNF-α mRNA 水平升高（P＜0.01）；與Aβ1-42組相比，姜黃素5和10 μmol·L-1組原代小膠質(zhì)細胞內(nèi)iNOS 和TNF-α mRNA 水平明顯降低（P＜0.01）（表3）。

Tab.2 Effect of Cur on iNOS，IL-6 and TNF-α mRNA expression in BV2cells with Aβ1-42 stimulation by qPCR

Tab.3 Effect of Cur on iNOS and TNF-α mRNA expression in primary microglia with Aβ1-42 stimulation by qPCR

2.4 姜黃素對Aβ1-42誘導的BV2 細胞iNOS 蛋白表達的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖2A和B），與DMSO組相比，Aβ1-42組iNOS 蛋白表達升高（P＜0.01）；與Aβ1-42組相比，姜黃素5和10 μmol·L-1組iNOS蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of Cur on iNOS protein expression in BV2 cells with Aβ1-42 stimulation by Western blotting.

2.5 姜黃素對Aβ1-42誘導的BV2 細胞Atg-5 和P62蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響

Western 印跡結(jié)果顯示（圖3A，B 和C），與DMSO組相比，Aβ1-42組Atg-5和P62蛋白表達水平升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無統(tǒng)計學差異；與Aβ1-42組相比，姜黃素10 μmol·L-1組P62蛋白表達顯著減少（P＜0.01），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Atg-5蛋白表達增加（P＜0.01）。

2.6 姜黃素對BV2細胞吞噬Aβ1-42的影響

Western 印跡結(jié)果顯示（圖4A 和B），與Aβ1-42組相比，姜黃素10 μmol·L-1組對Aβ1-42蛋白的吞噬明顯增加（P＜0.01），姜黃素5 μmol·L-1組BV2細胞對Aβ蛋白的吞噬無顯著差異。

2.7 姜黃素對原代小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ1-42的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖5A和B），與Cyto D 10 mmol·L-1組相比，Aβ1-42組原代小膠質(zhì)細胞對Aβ1-42蛋白的吞噬明顯增加（P＜0.01）；與Aβ1-42組相比，姜黃素5 和10 μmol·L-1組原代小膠質(zhì)細胞對Aβ1-42蛋白的吞噬明顯增加（P＜0.01）。

2.8 姜黃素對原代小膠質(zhì)細胞Iba1 蛋白表達和吞噬Aβ1-42的影響

細胞免疫熒光結(jié)果顯示（圖6A和B），與Cyto D 10 mmol·L-1組相比，Aβ1-42組原代小膠質(zhì)細胞對Aβ1-42-FITC 的吞噬和Iba1 蛋白表達明顯增加（P＜0.01）；與Aβ1-42組相比，姜黃素5 和10 μmol·L-1組平均每個細胞內(nèi)Aβ1-42-FITC 的熒光強度明顯增加（P＜0.01），Iba1 的熒光強度降低（P＜0.01）。說明姜黃素5 和10 μmol·L-1組原代小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ1-42-FITC蛋白增加，Iba1蛋白表達降低。

Fig.3 Effect of Cur on autophagy-related protein 5（Atg-5）and P62 protein expression and LC3-Ⅱto LC3-Ⅰratio in BV-2 cells with Aβ1-42 stimulation by Western blotting.

2.9 姜黃素對Aβ1-42誘導的敲降Atg-5的BV2細胞iNOS, Atg-5, P62蛋白表達和LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影響

Fig.4 Effect of Cur on autophagy Aβ1-42 in BV2 cells by Western blotting.

Fig.5 Effect of Cur on autophagy Aβ1-42 in primary microglia by Western blotting.

Fig.6 Effect of Cur on autophagy Aβ1-42 and expression of Iba1 protein in primary microglia by immunofluores? cence.

Western印跡結(jié)果顯示（圖7A），與載體細胞組相比，shAtg-5 BV2細胞內(nèi)Atg-5蛋白表達明顯減少（P＜0.01），而姜黃素5 和10 μmol·L-1對細胞Atg-5蛋白表達無顯著影響，BV2 細胞內(nèi)Atg-5 的敲降效率約達41.8%；與載體細胞組相比，shAtg-5 BV2細胞內(nèi)iNOS 和P62 蛋白表達升高（P＜0.01），shAtg-5 BV2 細胞內(nèi)無LC3-Ⅱ蛋白表達，說明敲降Atg-5使BV2細胞自噬能力減弱而細胞炎癥水平升高。在shAtg-5 BV2 細胞中，與DMSO 組相比，Aβ1-42組細胞內(nèi)iNOS 和P62 蛋白的表達水平升高（P＜0.01）；與Aβ1-42組相比，姜黃素5和10 μmol·L-1組細胞內(nèi)的iNOS 和P62 蛋白表達無顯著差異，姜黃素對shAtg-5 BV2細胞的炎癥水平無影響。而在載體對照細胞中，與Aβ1-42組相比，姜黃素5 和10 μmol·L-1組細胞內(nèi)的iNOS和P62蛋白表達減少（P＜0.01），Atg-5 蛋白表達增加（P＜0.01）（圖7B 和C）；與Aβ1-42組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（0.712±0.067）相比，姜黃素10 μmol·L-1組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（1.152±0.107）顯著升高（P＜0.01），姜黃素促進細胞自噬而抑制細胞炎癥水平。

Fig.7 Effect of Cur on iNOS，Atg-5,P62 protein expres?sion and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰprotein ratio in BV2 cells knocked down Atg-5 gene（shAtg-5 BV2 cells）with Aβ1-42 stimulation by Western blotting.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，姜黃素濃度≤25 μmol·L-1時，BV2細胞存活率與DMSO對照組相近，無明顯細胞毒性。姜黃素可一定程度地抑制Aβ1-42刺激所導致炎癥反應。利用穩(wěn)定敲降Atg-5的BV2細胞進一步驗證，姜黃素能夠通過促進細胞自噬而抑制小膠質(zhì)細胞炎癥反應，促進小膠質(zhì)細胞對Aβ蛋白的吞噬。

有研究表明，姜黃素能夠抑制小膠質(zhì)細胞內(nèi)NO 含量、iNOS 蛋白的表達及iNOS mRNA 表達，抑制小膠質(zhì)細胞的激活及TNF-α，IL-6和IL-1β等炎癥因子的釋放[7-8]，從而阻止進一步招募炎癥細胞的聚集，過度激活的小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元造成損傷。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能夠抑制小膠質(zhì)細胞的激活。此外，姜黃素能夠一定程度地促進小膠質(zhì)細胞對Aβ的吞噬。

姜黃素具有抗炎和抗氧化等作用，姜黃素抑制LPS刺激的小膠質(zhì)細胞激活[9]。LPS能夠刺激小膠質(zhì)細胞激活，但是并不能有效準確模擬AD 疾病和觀察小膠質(zhì)細胞的激活。有研究表明，Aβ1-42的寡聚體對細胞具有毒性作用并能刺激小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應[10]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能夠抑制BV2 細胞中iNOS 蛋白的表達及TNF-α，IL-6 和iNOS mRNA 水平，一定濃度的姜黃素能夠抑制Aβ1-42刺激所導致的BV2細胞炎癥反應。

自噬是真核細胞內(nèi)極保守的一種自我清理分解過程，這一過程在生物生長、疾病產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外環(huán)境中起著至關重要的作用。據(jù)報道，姜黃素、白藜蘆醇和紫杉醇等草本提取物能誘導細胞自噬過程導致腫瘤細胞程序性死亡[16]。也研究表明，姜黃素通過影響細胞自噬調(diào)控細胞凋亡過程及對凋亡產(chǎn)物的清理[11]。而最近研究表明，膠質(zhì)細胞可以通過細胞自噬降解細胞外的Aβ 蛋白并能調(diào)控NLRP3 炎性小體[4]，而NLRP3 的激活會有助于APP/PS1 小鼠AD 疾病的發(fā)生[17]。有研究表明，姜黃素能通過PI3K/AKT信號通路抑制小膠質(zhì)細胞的激活[9]及抑制磷酸化的JNK通路以阻礙蛋白翻譯過程，進而改善神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性病變導致的AD 癥狀[10]。本研究結(jié)果顯示，一定濃度的姜黃素能增強BV2 細胞中Atg-5 蛋白的表達，增高BV2 細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和降低P62 蛋白的表達，姜黃素基本不改變穩(wěn)定敲降Atg-5 的BV2 細胞中iNOS 蛋白表達。本研究結(jié)果顯示，姜黃素增強小膠質(zhì)細胞對Aβ 蛋白的吞噬。姜黃素是否能通過細胞自噬作用影響小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的炎癥水平還有待進一步的探討。

綜上所述，姜黃素能夠通過促進小膠質(zhì)細胞自噬而抑制Aβ 刺激所導致的小膠質(zhì)細胞激活，并能促進小膠質(zhì)細胞對Aβ的吞噬。

致謝：感謝袁增強研究員和程金波副研究員在實驗過程中給予指導和幫助。