張曉文，范 娜，郭耀東，王學軍，程 敏

（商洛學院健康管理學院護理系，陜西 商洛726000）

病毒性心肌炎是由病毒感染引起局灶性或彌散性心肌炎性病變，易引發(fā)炎癥細胞浸潤、心肌細胞變性和壞死，導致心功能損害[1-2]。病毒感染會直接造成對心肌細胞損害，激活后的免疫反應(yīng)在清除病毒時，會對心肌組織造成進一步損害，導致心臟損傷加劇[3]。巨噬細胞是一類可塑性大、免疫功能多樣的多變細胞群體，能觸發(fā)機體的炎癥反應(yīng)，在不同微環(huán)境中，可被誘導分化為致炎型（M1）或抗炎型（M2）巨噬細胞[4]，決定該細胞在炎癥的發(fā)生發(fā)展所發(fā)揮的重要不同作用。有研究表明，病毒感染引起的心肌損傷與巨噬細胞的極化有關(guān)[5]。香葉木素（diosmetin）是一種天然黃酮類化合物，以游離型或糖苷型在自然界中廣泛分布，目前，關(guān)于香葉木素的研究相對較少，主要集中在抗腫瘤方面。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素能通過抑制炎癥因子的表達，減少炎癥細胞的浸潤，降低組織的炎癥損傷，發(fā)揮較強的抑菌抗炎和抗氧化作用[6-7]。目前關(guān)于香葉木素調(diào)節(jié)巨噬細胞的研究尚無報道，因此本文通過構(gòu)建柯薩奇病毒B3（coxsackie virus B3，CVB3）誘導的病毒性心肌炎模型，探討香葉木素能否通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化反應(yīng)，實現(xiàn)對CVB3 誘導的病毒性心肌炎的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

干擾素γ（interferon-gamma，IFN-γ）購于北京同立海源生物科技有限公司；香葉木素購于陜西永源生物有限公司（CAS：520-34-3，HPLC≥98%）；CVB3來自于上海中山醫(yī)院病毒性心臟病重點實驗室。小鼠肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和CK-MB 同工酶（CK MB isoenzyme，CK-MB）試劑盒（上海研生生化試劑有限公司）；TUNEL染色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；HE 染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；活化的胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶9、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）和GAPDH等（Santa Cruz 公司，美國）；辣根過氧化物酶標記（HRP）山羊抗兔IgG、HRP 羊抗小鼠IgG（Thermo公司，美國）；兔抗小鼠F4/80，iNOS，F(xiàn)TLR4，CD40，CD14，CD11b，Arg-1 和CD206 多克隆抗體（BD 公司，美國）；1640 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素等（上海生工生物股份有限公司）；細胞裂解液、ECL化學發(fā)光試劑及其他試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

濕轉(zhuǎn)儀（AB 公司，美國），凝膠成像系統(tǒng)（DNR公司，以色列）；電泳儀、圖像采集和圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，美國），大、小鼠無創(chuàng)血壓儀MRBP（上海玉研科學儀器有限公司）；XD-202倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；DNM-9606 酶標分析儀（北京朗普新技術(shù)有限公司）；FACSCalibur 流式細胞儀（BD公司，美國），BioLab-410 型生物信號采集和處理系統(tǒng)等其他儀器（eppendorf公司，德國）。

1.2 動物、分組和模型制備

45 只出生24 h 內(nèi)的BALB/c 乳小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2017-0022。將乳鼠隨機分為5組：正常對照組、模型組及香葉木素12.5，25 和50 mg·kg-1組。以注射病毒當天為第0 天，正常對照組給予100 mL培養(yǎng)液，模型組和香葉木素組單次ip 0.1 mL 1×105空斑形成單位（plaque-forming unit，pfu）CVB3。第1 天起，正常對照組和模型組每日ig 給予0.5 mL生理鹽水，香葉木素組分別給予0.5 mL劑量為12.5，25 和50 mg·kg-1的香葉木素，連續(xù)給予7 d，所有動物操作及處理過程均受實驗動物監(jiān)測中心批準。

1.3 心功能指標檢測

應(yīng)用小動物血壓測量計，采用套尾法利用MRBP 生物信號采集分析系統(tǒng)測定各組乳小鼠尾部平均動脈壓（MAP）。將乳小鼠右側(cè)頸總動脈插管至左心室，連接BioLab-410型生物信號采集和處理系統(tǒng)測定心率（heart rate，HR）和左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）；檢測結(jié)束后活體摘除眼球取血約0.5 mL，1006×g 離心20 min，留取血清待測；將乳小鼠處死，無菌條件下分離其心肌組織，用多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用于免疫組化分析及組織蛋白提取。

1.4 ELISA檢測乳小鼠血清心損傷標記物水平

依照ELISA 試劑盒說明對乳鼠血清中心損傷標記物Mb，CK-MB 和CK 進行檢測，將樣本加入反應(yīng)孔，37℃孵育45 min，洗滌后依次加檢測抗體、生物熒光色標記抗體、鏈霉親和素-HRP，分別在37℃孵育30 min。加顯色液避光顯色15 min，加終止液混勻，在450 nm波長下吸光度值（A450nm）檢測。

1.5 HE染色觀察乳小鼠心肌組織病理結(jié)構(gòu)

將組織切片用二甲苯溶液浸泡5 min，浸泡2 次；后梯度乙醇水合，即依次在無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各浸泡5 min；PBS浸洗3次，然后依次浸入蘇木素染液內(nèi)染色3～5 min，水洗30～60 s；酸水浸潤20 s，水洗30～60 s；氨水中浸潤40 s，水洗30～60 s；最后置伊紅染液中染色2 min，再洗去多余染液，濾紙吸干，迅速滴加適量中性樹膠，蓋玻片封固，顯微鏡下觀察染色情況并分析。

1.6 TUNEL染色觀察乳小鼠心肌細胞凋亡

取乳鼠心肌組織切片，按試劑盒說明要求，依次使用二甲苯和濃度梯度乙醇溶液清洗，用蛋白酶K 溶液室溫處理15 min，PBS 清洗4 次。10%中性甲醛固定2 次，分別用乙醇乙酸和3%過氧化氫浸潤，PBS清洗后加TdT酶緩沖溶液孵育5 min；PBS清洗后加預(yù)熱的終止液，終止反應(yīng)20 min，PBS 清洗2 次，滴加過氧化酶標記物抗體，孵育20 min 后PBS清洗，加DAB顯色液，顯色30 min用無水乙醇和二甲苯固定，晾干，熒光封片試劑封片。2 h內(nèi)熒光顯微鏡下觀察。凋亡率（%）=陽性細胞/總細胞×100%。

1.7 Western 印跡法檢測心肌組織中活化的胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶9表達水平

提取心肌組織中總蛋白，采用Bradford 調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的PVDF 膜，密封2 h，加入兔抗小鼠活化的胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶9 和GAPDH 一抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST 漂洗40 min，加入HRP 標記的二抗（1∶500）孵育1 h，TBST 漂洗40 min，ECL 發(fā)光液將PVD 膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶吸光度值，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達水平。

1.8 流式細胞術(shù)分析乳小鼠外周血清中巨噬細胞M1/M2極化

取各組小鼠外周血0.5 mL 于流式上樣管，按F4/80，iNOS，F(xiàn)TLR4，CD40，CD14，Arg-1和CD206抗體說明書，根據(jù)抗體組合方案，每管分別加5 μL抗體，避光孵育20 min；71.6×g 離心5 min，棄上清PBS 清洗1 次，54.8×g 離心5 min，收集沉淀加500 μL PBS 重懸，300 目篩子過濾，30 min 內(nèi)上機檢測，Cell Quest軟件進行細胞分類分析。

1.9 Western 印跡法檢測乳小鼠巨噬細胞中iNOS和Arg-1蛋白表達水平

巨噬細胞分離：在無菌條件下分離正常乳小鼠的脾，用無菌37℃PBS清洗至無明顯血液，用研磨器制備單核細胞懸液，按紅細胞裂解液使用說明書裂解紅細胞，用40 目尼龍網(wǎng)過濾，收集溶液于15 mL離心管，71.6×g離心7 min，收集沉淀。PBS清洗3次，調(diào)整細胞密度為3×109L-1，于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，次日用CD14和CD11b抗體標記，流式細胞術(shù)分選巨噬細胞。調(diào)整巨噬細胞密度為2.5×108L-1，2 mL 接種于6 孔板，37℃，5%CO2條件下，過夜培養(yǎng)（約16 h）。

分組：分為正常對照組、IFN-γ 5 mg·L-1誘導組、CVB3 1×105pfu 病毒誘導組、香葉木素20 μmol·L-1組和CVB3 1×105pfu 病毒+香葉木素20 μmol·L-1組，處理細胞24 h后，PBS清洗1次，收集細胞于1.5 mL 離心管，細胞裂解液冰浴裂解30 min。取上清，酶標儀490 nm 波長蛋白定量。12% SDS-PAGE 電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，4℃條件依次加封閉液孵育2 h，一抗孵育過夜（稀釋比例均為1∶1 000），二抗孵育2 h（稀釋比例均為1∶5 000）。用ECL 化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶，蛋白表達定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，內(nèi)參采用GAPDH，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 香葉木素對CVB3誘導的病毒性心肌炎乳小鼠心功能的影響

各組小鼠藥物處理7 d 后心功能檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠MAP，HR 和LVSP顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，香葉木素12.5，25和50 mg·kg-1治療后乳小鼠的上述指標均顯著增加（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of diosmetin（Dio）on mean arterial pres?sure（MAP），heart rate（HR）and left ventricular systolic pressure（LVSP）in mice with coxsaickie virus B3（CVB3）-induced viral myocarditis

2.2 香葉木素對CVB3誘導的病毒性心肌炎乳小鼠血清中心肌損害指標的影響

與正常對照相比，模型組乳小鼠血清中CK，CK-MB和Mb水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，香葉木素12.5，25和50 mg·kg-1組乳小鼠血清中上述指標水平顯著降低（P＜0.05）（表2）。

2.3 香葉木素對CVB3誘導的病毒性心肌炎乳小鼠心肌組織損害和心肌細胞凋亡的影響

2.3.1 HE染色

HE染色結(jié)果（圖1）顯示，正常對照組乳鼠的心肌組織胞漿豐富紅染，細胞排列緊密有序，橫紋清晰；模型組心肌組織細胞排列疏散、橫紋不清，細胞水腫、胞漿疏松、淡染，細胞變形壞死，存在大量炎癥細胞浸潤；香葉木素12.5 mg·kg-1治療后，細胞排列疏散情況有一定的緩解，且胞漿染色加深，炎癥細胞浸潤情況也得到一定緩解；香葉木素25.0 mg·kg-1治療后，心肌組織細胞排列疏散情況得到很好的改善，細胞變形壞死情況減少，并且細胞水腫情況也較模型組改善；香葉木素50.0 mg·kg-1治療后，細胞排列緊密有序，橫紋清晰，存在少量細胞水腫及炎癥細胞浸潤。

Tab.2 Effect of Dio on creatine kinase（CK），creatine kinase MB isoenzyme（CK-MB）and myoglobin（Mb）in serum of mice with CVB3-induced viral myocarditis

2.3.2 TUNEL染色

TUNEL 染色結(jié)果（表3 和圖2）顯示，與正常對照組相比，模型組乳小鼠心肌組織中凋亡細胞比例顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，香葉木素12.5，25.0 和50.0 mg·kg-1治療后乳小鼠該比例顯著降低（P＜0.05）。

Tab.3 Effect of Dio on myocardial cell apoptosis of suckling mice with CVB3-induced viral myocarditis

2.4 香葉木素對CVB3誘導的病毒性心肌炎乳小鼠心肌組織中活化的胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶9蛋白表達的影響

Western印跡結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組活化的胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶9表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，香葉木素12.5，25.0和50.0 mg·kg-1治療后乳小鼠心肌組織中兩者表達水平顯著降低（P＜0.05）（圖3）。

2.5 香葉木素對CVB3誘導的病毒性心肌炎乳小鼠外周血中巨噬細胞M1/M2極化的影響

Fig.2 Effect of Dio on myocardiocyte apoptosis of suckling mice with CVB3-induced viral myocarditis by TUNEL staining.

流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組M1 型巨噬細胞F4/80+iNOS+，F(xiàn)4/80+TLR4+和F4/80+CD40+的細胞百分比顯著升高（P＜0.05），M2型巨噬細胞F4/80+CD14+，F(xiàn)4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的細胞百分比明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，香葉木素12.5，25.0 和50.0 mg·kg-1組乳小鼠前者的細胞百分比顯著降低（P＜0.05），后者的細胞百分比明顯升高（P＜0.05）（圖4，圖5和表4）。

2.6 香葉木素對乳小鼠脾巨噬細胞中iNOS和Arg-1蛋白表達的影響

Western印跡結(jié)果顯示，IFN-γ與CVB3病毒處理均能上調(diào)乳小鼠脾巨噬細胞iNOS 表達，抑制Arg-1的表達；香葉木素處理則能抑制細胞iNOS的表達，上調(diào)Arg-1的表達；與CVB3病毒處理單獨處理相比，CVB3 病毒+香葉木素處理后iNOS 表達降低，Arg-1表達升高（P＜0.05）（圖6）。

Fig.5 Effect of Dio on M2 macrophage in peripheral blood of suckling mice after CBV3 treatment.

Tab.4 Effect of Dio on macrophage M1/M2 polarization in peripheral blood of suckling mice with CVB3-induced viral myocarditis

Fig.6 Effect of Dio expression of inducible nitric oxides synthase (iNOS) and arginase-1 (Arg-1) protein in peripheral blood of suckling mice with CVB3-induced viral myocarditis by Western blotting.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，乳小鼠注射CVB3 后，其MAP，HR和LVSP指數(shù)顯著降低，血清中CK，CK-MB和Mb 水平顯著升高（P＜0.05）；通過HE 染色病理分析顯示，心肌組織細胞排列疏散、橫紋不清，細胞水腫、胞漿疏松、淡染，細胞變形壞死，存在大量炎癥細胞浸潤；同時凋亡蛋白活化的胱天蛋白酶3 和活化的胱天蛋白酶9表達水平和凋亡細胞比例顯著升高（P＜0.05），表明通過CVB3 注射成功構(gòu)建病毒性心肌炎乳小鼠模型[8]。經(jīng)香葉木素治療后，隨著劑量的增加，乳小鼠MAP，HR和LVSP指數(shù)顯著升高，血清中CK，CK-MB 和Mb 水平明顯降低（P＜0.05），心肌組織中活化的胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶9 表達水平明顯降低，且凋亡細胞比例也顯著降低（P＜0.05）。表明香葉木素能通過抑制細胞凋亡，改善和修復(fù)病毒性心肌炎造成的心功能損害。其可能機制是香葉木素具有抗氧化及抑制炎性介質(zhì)分泌的作用，通過抑制NF-κβ信號途徑的轉(zhuǎn)導并激活Nrf2/NQO1 途徑來緩解CVB3 病毒感染后引起的炎癥介質(zhì)大量合成，從而緩解對心肌細胞的損害。

有研究指出，CVB3 感染能引起巨噬細胞的極化發(fā)展，M1 型巨噬細胞在病毒性心肌炎發(fā)展過程中具有致病作用[9]，而M2型巨噬細胞表現(xiàn)為對病毒性心肌炎的保護作用[10]。通過不同的特異性生物標志物，可鑒別不同巨噬細胞亞型，其中iNOS，TLR-4和CD40 等是M1 型巨噬細胞的生物標志物[11-12]；CD14，CD206和Arg-1等是典型的M2型巨噬細胞的生物標志物[13-14]。本研究通過抗體標記用流式細胞術(shù)對CVB3構(gòu)建的心肌炎模型乳鼠外周血中巨噬細胞檢測。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組乳小鼠外周血中F4/80+iNOS+，F(xiàn)4/80+TLR4+和F4/80+CD40+的細胞百分比顯著升高，而F4/80+CD14+，F(xiàn)4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的細胞百分比明顯降低（P＜0.05），表明CVB3 能促進巨噬細胞向M1極化發(fā)展。Wang等[15]的研究也證實，病毒感染能通過促進巨噬細胞向M1 極化發(fā)展，加重心臟損害。但隨著香葉木素治療劑量的增加，F(xiàn)4/80+iN?OS+，F(xiàn)4/80+TLR4+和F4/80+CD40+的細胞百分比顯著降低，F(xiàn)4/80+CD14+，F(xiàn)4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的細胞百分比明顯升高，提示香葉木素能抑制CVB3 對巨噬細胞向M1 極化的誘導作用，促進其向M2型極化，發(fā)揮保護心臟作用。

本研究結(jié)果顯示，利用IFN-γ 和CVB3 處理脾來源的巨噬細胞后，巨噬細胞中iNOS等M1巨噬細胞細胞標志物的表達量顯著升高，M2 型巨噬細胞標志物Arg-1 表達顯著降低，這也表明CVB3 引起的M1 巨噬細胞極化可能與IFN-γ 的功能相關(guān)[16]。有研究顯示，IFN-γ 能通過激活細胞的STAT3 通路[17]，進一步誘導巨噬細胞iNOS 等炎癥因子的表達，抑制Arg-1的表達促進巨噬細胞向M1型的極化發(fā)展[18-19]，而香葉木素單獨處理后發(fā)現(xiàn)iNOS 的表達降低，Arg-1 表達升高，CBV3 聯(lián)合香葉木素處理后能抑制CBV3 引起的M1 型巨噬細胞極化，提示香葉木素能提升巨噬細胞Arg-1 的表達水平，抑制iNOS的表達，促進巨噬細胞的M2型極化發(fā)展。

綜上所述，香葉木素能抑制因病毒感染引起的M1 型巨噬細胞的活化，促進其向M2 型極化發(fā)展，改善病毒性心肌炎模型的心功能。但其具體作用機制尚不明確，有待深入研究。