韓靜,董志紅,蒲艷,宋建忠,張萌萌,柳惠斌

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤防治研究所,烏魯木齊830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)

腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是腎細(xì)胞癌中最常見的組織學(xué)亞型，占全部腎細(xì)胞癌的65%～70%[1]。目前，腎癌最有效的治療手段仍以手術(shù)為主。然而，腎癌發(fā)病隱匿，早期無特異的臨床癥狀和體征，患者確診時多已出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療的機(jī)會[2～4]。迄今為止，腎癌仍缺乏一種如前列腺特異性抗原(PSA)對前列腺癌[5]、甲胎蛋白對原發(fā)性肝癌[6]那樣簡易、非侵襲性的早期診斷和治療隨訪生物標(biāo)志物，這是腎癌研究領(lǐng)域的一個重大難題。NDUFA4L2 是線粒體復(fù)合物1的一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子，已被鑒定為缺氧誘導(dǎo)因子的靶基因并定位于線粒體[7]。應(yīng)用mRNA微陣列技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，NDUFA4L2在VHL缺陷型細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞、缺氧和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等病理生理?xiàng)l件下的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中均呈現(xiàn)過表達(dá)[8～11]。有研究顯示，NDUFA4L2在ccRCC組織中表達(dá)增高，可作為腎癌診斷的新型標(biāo)志物[12]。然而，目前尚未見到有關(guān)NDUFA4L2 在腎癌患者外周血中表達(dá)及其與腎癌發(fā)病風(fēng)險關(guān)系的報道。本研究旨在通過檢測ccRCC組織及外周血中NDUFA4L2的表達(dá)，分析NDUFA4L2與患者臨床病理特征的相關(guān)性，探討其臨床診斷價值，評價其作為腎癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年1月～2018年9月于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科就診的72例ccRCC患者手術(shù)切除的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織(距離癌組織3 cm)?；颊咝g(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療，排除伴發(fā)器質(zhì)性或系統(tǒng)性疾病，如糖尿病、高血壓等，及合并其他腫瘤者。其中男47例、女25例，年齡35～80歲，中位年齡50歲。ccRCC的臨床診斷依據(jù)為術(shù)后組織病理檢查。另收集同期相同入組標(biāo)準(zhǔn)的102例ccRCC患者術(shù)前的靜脈血液標(biāo)本作為腎癌組，以同期于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院體檢中心體檢的無腫瘤病史的68例健康體檢者的靜脈血液標(biāo)本作為對照組。對照組標(biāo)本收集前排除高血壓、糖尿病等全身性疾病，現(xiàn)階段無任何部位的細(xì)胞惡變。ccRCC的臨床診斷依據(jù)為術(shù)后組織病理檢查。其中腎癌組男61例、女41例，年齡32～82歲，中位年齡54歲(≤60歲72例，>60歲30例)；對照組男38例、女30例，年齡30～81歲，中位年齡56歲(≤60歲41例，>60歲27例)。兩組性別及年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織中NDUFA4L2表達(dá)檢測 腎癌組織及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本切下后迅速放入液氮中冷凍，并置于-80 ℃冰箱備用；采用RT-PCR法檢測腫瘤組織中NDUFA4L2表達(dá)，按照PrimeScriptTMRT Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix Ex Taq Ⅱ擴(kuò)增試劑盒 說明書要求，組織RNA提取試劑TRIzol提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。內(nèi)參GAPDH及NDUFA4L2引物由Primer5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST比對后由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：GAPDH正向引物：5′-TGACTTCAACAGCAGCACCCA-3′,反向引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；NDUFA4L2正向引物：5′-ACGATATGGCAGGAGCCAGT-3′,反向引物：5′-CAGGCAGATTAAGCCGATCA-3′。應(yīng)用實(shí)時定量PCR擴(kuò)增儀(ABI 7500)檢測每個擴(kuò)增循環(huán)后SYBR Green熒光信號水平，20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 s后，進(jìn)行40個循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 運(yùn)用溶解曲線檢測擴(kuò)增產(chǎn)物純度。每個樣本重復(fù)3次。NDUFA4L2的2ΔCt值代表腎癌組織及癌旁組織中NDUFA4L2表達(dá)與內(nèi)參基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)關(guān)系。2-ΔΔCt值越大表示NDUFA4L2在腫瘤組織中表達(dá)越顯著。

1.3 外周血NDUFA4L2的檢測 收集ccRCC患者手術(shù)前及健康體檢者外周血標(biāo)本5 mL，置于BD靜脈真空采血管(PreAnalytiX, 瑞士)，采血后，立即顛倒采血管10～20 次，使之與RNA保護(hù)液充分混合，室溫靜置2 h, 轉(zhuǎn)移到4 ℃放置6 h或過夜，再轉(zhuǎn)移至-20 ℃放置6 h或過夜，最后轉(zhuǎn)移至-80 ℃長期保存。采用RT-PCR法檢測外周血中NDUFA4L2表達(dá)，按全血RNA提取試劑盒說明書要求，提取外周血總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。內(nèi)參GAPDH及NDUFA4L2引物由Primer5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST比對后由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：GAPDH正向引物：5′-TGACTTCAACAGCAGCACCCA-3′,反向引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；NDUFA4L2正向引物：5′-ACGATATGGCAGGAGCCAGT-3′,反向引物：5′-CAGGCAGATTAAGCCGATCA-3′。應(yīng)用實(shí)時定量PCR擴(kuò)增儀(ABI 7500)檢測每個擴(kuò)增循環(huán)后SYBR Green熒光信號水平，20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 s后，進(jìn)行40個循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s, 運(yùn)用溶解曲線檢測擴(kuò)增產(chǎn)物純度。每個樣本重復(fù)3次。根據(jù)RT-PCR數(shù)據(jù)計(jì)算出的2ΔCt值代表NDUFA4L2與內(nèi)參基因表達(dá)水平的相對倍數(shù)關(guān)系，2-ΔΔCt值越大表示NDUFA4L2水平越高。

2 結(jié)果

2.1 外周血NDUFA4L2表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系 腎癌組與對照組外周血NDUFA4L2的相對表達(dá)量分別為0.304 ±0.148、0.160±0.045，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。外周血中NDUFA4L2表達(dá)與TNM分期和Fuhrman分級有關(guān)(P均<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑等無關(guān)(P均<0.05)，見表1。

表1 外周血NDUFA4L2表達(dá)與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 ccRCC組織中NDUFA4L2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 ccRCC組織及其相應(yīng)癌旁組織中NDUFA4L2的相對表達(dá)量分別為1.20±0.41、0.45±0.12，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NDUFA4L2表達(dá)與ccRCC TNM分期和Fuhrman分級相關(guān)(P均<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑等無關(guān)(P均<0.05)，見表2。

2.3 外周血NDUFA4L2在ccRCC診斷中的價值 外周血NDUFA4L2診斷ccRCC繪制的ROC曲線下面積 (AUC)為0.876 (95%CI：0.816～0.933,P<0.01) 。根據(jù) ROC曲線的坐標(biāo)值計(jì)算Youden指數(shù) (靈敏度+特異度-1) 確定診斷界值。當(dāng)診斷界值為0.235時，其靈敏度為81.4%，特異度為91.2%。外周血NDUFA4L2診斷TNM Ⅰ～Ⅱ期ccRCC的AUC為0.817 (95%CI：0.718～0.917,P<0.01)，靈敏度為85.3%，特異度為61.8%。

表2 ccRCC組織中NDUFA4L2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

目前，超過50%的腎癌是通過非針對性的影像學(xué)檢查偶然發(fā)現(xiàn)的，早期局限性腎癌和局部進(jìn)展性腎癌主要治療手段為手術(shù)切除，但40%～50%的局限性腎癌患者即使手術(shù)后仍可繼發(fā)轉(zhuǎn)移[13,14]。當(dāng)前，提高腎癌療效的關(guān)鍵在于早期確診、早期治療。但迄今為止腎癌仍缺乏一種簡易、非侵襲性的早期診斷和治療隨訪生物標(biāo)志物。因此，加強(qiáng)腎癌的基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)新的早期診斷和預(yù)警生物標(biāo)志物對提高腎癌的療效有重要意義。

已有研究證實(shí)，NDUFA4L2在ccRCC組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)隨AJCC分期進(jìn)展而增加。NDUFA4L2可能通過與多個腫瘤相關(guān)蛋白相互作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長與死亡進(jìn)程[15]。NDUFA4L2過表達(dá)在ccRCC中有重要意義，可作為獨(dú)立的危險因子影響腎癌患者預(yù)后，是ccRCC潛在的治療靶點(diǎn)[16]。李雪峰等[12]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NDUFA4L2基因在ccRCC組織中的表達(dá)高于配對的癌旁組織，ROC曲線提示組織中NDUFA4L2的表達(dá)對ccRCC有良好的診斷價值。上述研究表明，NDUFA4L2不僅是ccRCC病理生理進(jìn)程中關(guān)鍵的功能基因，還可能是一種優(yōu)良的腫瘤標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，無論在癌組織還是腎癌患者外周血，NDUFA4L2表達(dá)水平均升高且與疾病分期及Fuhrman分級相關(guān)。根據(jù)外周血NDUFA4L2表達(dá)水平繪制的ROC曲線結(jié)果顯示，NDUFA4L2診斷ccRCC的AUC為0.876,在ccRCC診斷中表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。另外，NDUFA4L2在早期ccRCC診斷中亦顯示良好的診斷價值，有望通過檢測外周血中NDUFA4L2的水平篩查出更多的早期腫瘤患者，有助于改善預(yù)后。鑒于目前ccRCC診斷尚缺乏微創(chuàng)、靈敏度及特異度高的生物標(biāo)志物，本研究提示外周血NDUFA4L2作為ccRCC患者診斷的新型潛在循環(huán)腫瘤標(biāo)志物可能具有較高的臨床應(yīng)用價值和前景。后期，我們將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步明確NDUFA4L2的臨床轉(zhuǎn)化價值。