王 意， 張博涵， 陸一鳴， 周 欣， 王 驍，王柳妍， 賀小賢， 劉 歡

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種條件致病菌，主要存在于海水、淡水、河流、湖泊等水環(huán)境以及污泥、土壤、人類糞便中，是我國淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類爆發(fā)性細菌疾病的主要病原菌[1]，可以感染草魚、鯉魚、鯽魚以及羅非魚等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類.此外，嗜水氣單胞菌還可以感染人類，能引發(fā)人類的中耳炎、敗血癥及創(chuàng)傷面感染、腹膜炎以及急性腸胃炎等疾病的發(fā)生[2].在國外，嗜水氣單胞菌已經(jīng)被列入食品衛(wèi)生檢驗的對象和醫(yī)院腹痛腹瀉病原菌檢測的一項內(nèi)容.因此，嗜水氣單胞菌相關(guān)疾病的爆發(fā)不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，還直接對人類健康造成威脅，受到水產(chǎn)、醫(yī)學(xué)界的重視[3].

目前，我國對于嗜水氣單胞菌病害的防治主要采用抗生素方法，長期使用抗生素，不僅會破壞畜禽的胃腸道微生態(tài)平衡、干擾其免疫系統(tǒng)、降低其對疾病的抵抗力，威脅畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且會造成藥物殘留，威脅食品安全以及人類健康[4].因此，開發(fā)高效安全的新型抑菌劑成為亟待解決的問題.

中草藥是天然物質(zhì)，安全可靠，毒副作用小，由于其抗菌作用的廣泛性和協(xié)同性而不易出現(xiàn)抗藥性，彌補了飼用抗生素的缺點.我國具有豐富的中草藥資源，目前，中草藥提取物已成為飼用抗生素替代品研究的熱點[5].而關(guān)于中草藥對嗜水氣單胞菌抑菌效果的研究已有報道.

例如，郭秀平等[6]進行了45種中草藥水提物對中華鱉源嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用研究，結(jié)果表明夏枯草、訶子、牡丹皮、地榆、黃芩、赤芍效果最佳，其次為黃蓮、大黃、連翹、烏梅、大青葉、丁香.趙蓓蓓等[7]進行了10種常見中草藥水提物對嗜水氣單胞菌ZHYYZ-1的體外抑菌效果研究，發(fā)現(xiàn)五倍子、金銀花、黃芩、蒲公英的抑菌效果明顯強于連翹、黃連、魚腥草、穿心蓮、大青葉和板藍根.

陶健等[8]研究了16種中草藥及5種復(fù)方制劑對4株嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩、訶子以及復(fù)方制劑三黃湯對嗜水氣單胞菌AH2和AH32的抑菌效果最好；訶子對嗜水氣單胞菌AH15抑菌效果最佳，而黃芩對AH15無抑菌效果；黃芩和訶子對嗜水氣單胞菌AH43抑菌作用最明顯.張其中[9]進行了不同中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：五倍子、訶子、黃連能有效抑制嗜水氣單胞菌，而黃芩、連翹、平貝等則無明顯的抑菌效果.可見，不同中草藥對嗜水氣單胞菌體外抑菌效果不盡相同，同一種中草藥對嗜水氣單胞菌不同菌株的抑菌作用也相差甚遠.

因此，針對本實驗室所分離的嗜水氣單胞菌致病株開展中草藥抑菌活性的研究是必要的.此外，關(guān)于中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌研究主要集中在體外抑菌效果上，而對于其內(nèi)在的抑菌機制尚未開展深入研究.同時，對于不同提取方法對中草藥抑菌效果的影響研究也較少.

本實驗選取四種常見中草藥黃芩、烏梅、野菊花、鳳尾草為原料，分別采取水提法和醇提法制備其水提物和醇提物，比較不同提取方法下中草藥對嗜水氣單胞菌抑菌作用的影響，選取抑菌效果良好提取物，通過二倍稀釋法確定其最小抑菌濃度，進一步地通過對菌體培養(yǎng)液的電導(dǎo)率、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)及蛋白質(zhì)含量等的測定，從細胞膜及細胞壁完整性等方面深入研究其對抑菌機理，旨在為開發(fā)安全高效的新型抗菌藥物提供理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 中草藥原料

黃芩、烏梅、野菊花、鳳尾草，四種中草藥均購自西安同仁大藥堂.

1.1.2 受試菌種

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)由本實驗室提供.

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備

LB培養(yǎng)基，1%NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母粉；堿性磷酸酶試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)公司.

HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)，YWF-300生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV290紫外可見分光光度計(舜宇恒平有限公司)；LE204E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；ZX-100電熱鼓風(fēng)干燥器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；GT10-1高速離心機(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；SHB-3循環(huán)水式多用真空汞(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FW-200高速萬能粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；THZ-C-1全溫振蕩器(太原培英儀器制造有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌菌懸液的制備

嗜水氣單胞菌：在已滅菌的含5 mL LB培養(yǎng)基血清瓶中按1%的接種量接種活化后的嗜水氣單胞菌，在恒溫搖床中30 ℃下震蕩(200 rpm)培養(yǎng)13 h.采用平板計數(shù)法計數(shù)，用液體培養(yǎng)基稀釋菌液至1×107CFU/mL，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.2 中草藥提取物的制備

分別采用水提法和醇提法[10,11]對四種中草藥進行提取物原液(1 mg/mL)的制備.水提法：以黃芩水提物為例，稱取黃芩粉末10 g，加入100 mL蒸餾水，使料液比為1∶10，浸泡2 h后超聲處理30 min，隨后先用武火加熱10 min，再保持文火煎煮30 min，四層紗布過濾收集一煎藥液，藥渣重新加入100 mL蒸餾水，武火加熱10 min，文火煎煮30 min，過濾掉殘渣收集二煎藥液，合并兩次藥液后3 000 rpm離心10 min，取其上清液加熱濃縮至10 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2,4 ℃保存?zhèn)溆?醇提法：以黃芩醇提物為例，稱取黃芩粉末10 g，加入五倍量的50%乙醇溶液，料液比為1∶6，浸泡24 h后用60 ℃恒溫水浴鍋熱浸3 h，四層紗布過濾收集藥液，將藥渣再加入五倍量的50%乙醇溶液熱浸3 h，過濾掉殘渣，合并兩次所得的醇浸液，4 500 rpm下離心10 min取其上清液，濃縮至原液濃度為1 g/mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2,4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 不同中草藥提取物抑菌活性的測定

采用濾紙片平皿擴散法[12].即取200μL已活化好的嗜水氣單胞菌懸液，均勻涂布于培養(yǎng)基，將高壓滅菌處理過的濾紙片(直徑為6 mm)浸蘸不同中草藥提取物原液并緊貼于培養(yǎng)皿表面，每板等距離放置三個做平行實驗，空白提取物作為對照組，置于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12至18 h，觀察是否具有透明抑菌圈，用游標(biāo)卡尺測量其直徑，取平均值，記錄數(shù)據(jù).

1.2.4 黃芩提取物最低抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法[13].將黃芩提取物原液(1 g/mL)稀釋配成50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563%六種濃度梯度.取200μL已活化的菌懸液均勻涂布于平板，每個平板等距離放置浸蘸了不同濃度梯度提取物的濾紙片，根據(jù)稀釋度從高到低的順序，先將6個濃度的藥液分為兩組，每組是3個相連的濃度，第四個濾紙片用無菌水作空白對照組，將制作好的培養(yǎng)皿放入4 ℃冰箱中冷藏3 h，待藥液完全擴散到瓊脂層后將培其放入37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)12～18 h，觀察嗜水氣單胞菌的生長情況，以確定不同濃度梯度的黃芩水提物對其的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)記錄數(shù)據(jù).

1.2.5 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌細胞膜的影響

(1)黃芩水提物對菌體培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

將嗜水氣單胞菌活化培養(yǎng)至對數(shù)期(4～6 h)，按1%的接種量接種到添加0.5 MIC、1 MIC和2 MIC黃芩水提物的液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床中培養(yǎng)[14]，以不加黃芩水提物的液體培養(yǎng)基作為空白對照，每隔兩小時取樣，直至八小時，轉(zhuǎn)速為3 500 rpm下離心10 min，取上清液用紫外分光光度計在450 nm波長下測其電導(dǎo)率，實驗至少重復(fù)3次.

(2)黃芩水提物對菌體培養(yǎng)液總漏出率的影響

嗜水氣單胞菌處理步驟同1.2.5中(1)所述.用紫外分光光度計在600 nm波長下測上清液的吸光值[15]，實驗至少重復(fù)3次.

1.2.6 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌菌細胞壁的影響

嗜水氣單胞菌處理步驟同1.2.5中(1)所述.用堿性磷酸酶試劑盒分別測定加入不同濃度黃芩水提物的菌懸液上清中的AKP含量，實驗至少重復(fù)3次[16].

1.2.7 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌菌蛋白質(zhì)含量的影響

嗜水氣單胞菌處理步驟同1.2.5中(1)所述.取上清液用考馬斯亮藍法測定胞外蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，實驗至少重復(fù)3次[17].

2 結(jié)果與討論

2.1 不同中草藥提取物對嗜水氣單胞菌抑菌活性的測定

2.1.1 不同中草藥水提物原液對嗜水氣單胞菌的抑菌作用

由表1可以看到，四種不同種類的中草藥水提物對嗜水氣單胞菌均具有抑菌作用，抑菌性大小排序為：黃芩水提物>野菊花水提物>烏梅水提物>鳳尾草水提物，黃芩水提物抑菌性效果最好.

表1 不同中草藥水提物原液對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑(mm)

注：b表示p<0.01.

2.1.2 不同中草藥醇提物原液對嗜水氣單胞菌的抑菌作用

由表2可以看到，四種不同種類的中草藥醇提物對嗜水氣單胞菌也具有一定抑菌作用，抑菌性大小排序為：黃芩醇提物>烏梅醇提物>野菊花醇提物=鳳尾草醇提物.

表2 不同中草藥醇提物原液對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑(mm)

注：b表示p<0.01.

綜上結(jié)果可知，所選取的四種中草藥中，黃芩提取物原液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最為顯著，因此，選取黃芩提取物進行后續(xù)MIC的測定及抑菌機制的研究.

2.2 黃芩提取物對嗜水氣單胞菌最小抑菌濃度的測定

對抑菌效果最好的黃芩水提物進行嗜水氣單胞菌MIC的測定.由表3、表4得出：不同濃度的黃芩水提物對嗜水氣單胞菌的抑菌效果呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，即抑菌效果與黃芩水提物的濃度正相關(guān)；黃芩水提物濃度為0.062 5 g/mL后對嗜水氣單胞菌無抑菌效果.黃芩水提物對嗜水氣單胞菌的MIC為0.125 g/mL.

表3 不同濃度的黃芩水提物對嗜水氣單胞菌抑菌圈直徑(mm)

表4 黃芩水提物的最低抑菌濃度

注：“-”表示無菌落生長，“+”表示有菌落生長，AH代表嗜水氣單胞菌

2.3 不同濃度的黃芩醇提物對嗜水氣單胞菌的抑菌作用

對黃芩醇提物進行二倍稀釋，測定不同濃度黃芩醇提物對嗜水氣單胞菌的抑菌效果，確定最小抑菌濃度.由表5，表6可以得出：不同濃度的黃芩醇提物對嗜水氣單胞菌的抑菌效果呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，即抑菌效果與黃芩水提物的濃度正相關(guān).黃芩醇提物對嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度為0.25 g/mL.比較黃芩水提物和醇提物的抑菌效果得知，黃芩水提物抑菌效果較好，故本實驗后期選取黃芩水提物來研究其抑菌機制.

表5 不同濃度的黃芩醇取物對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑(mm)

表6 黃芩醇提物的最低抑菌濃度

注：“-”表示無菌落生長，“+”表示有菌落生長

2.4 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌細胞膜的影響

2.4.1 黃芩水提物對菌體培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

不同濃度黃芩水提物作用于嗜水氣單胞菌后，菌體培養(yǎng)液的電導(dǎo)率變化如圖1所示.結(jié)果顯示，未添加黃芩水提物的對照組中，菌體培養(yǎng)液電導(dǎo)率在培養(yǎng)時間內(nèi)基本保持恒定；而在添加不同濃度黃芩水提物后，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率相較對照組增大，且隨藥液濃度的增加和處理時間的延長而升高.

圖1 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌電導(dǎo)率的影響

2.4.2 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液總漏出率的影響

黃芩水提物作用于嗜水氣單胞菌后菌體培養(yǎng)液的總漏出率的變化如圖2所示.由圖2可知，未加藥液處理的對照組中，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液總漏出率在整個培養(yǎng)過程中始終與培養(yǎng)初期基本保持一致，未出現(xiàn)明顯變化；而添加了不同濃度黃芩水提物后，總漏出率較對照組顯著增加，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，同時，菌體培養(yǎng)液的總漏出率呈現(xiàn)出時間正相關(guān)性.當(dāng)藥液濃度為2MIC時，總漏出率在6 h時達到最大值，之后有所下降.

圖2 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌總漏出率的影響

研究表明，中草藥是通過多靶點機制抑制致病菌生長或殺死致病菌，常見的靶點包括菌體的細胞膜、細胞壁、核酸、酶等，而抑菌機制包括破壞胞壁和胞膜結(jié)構(gòu).鄭翠萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)茜草丙酮提取物通過降解細胞壁或細胞膜中的酶，使膜通透性提高影響枯草芽孢桿菌的生長繁殖.Yong等[19]證明紫珠葉、野牡丹、半枝蓮3種植物提取物通過破壞大腸桿菌與銅綠假單胞菌的細胞膜通透性與完整性而起到抑菌作用.侯偉峰等[20]與謝晶等[21]分別研究了植酸對大腸桿菌與腐敗希瓦氏菌的作用機制，結(jié)果得出其對2種菌的MIC分別為0.4%、0.2%，植酸主要通過破壞菌體細胞壁與細胞膜的完整性使細胞質(zhì)外滲，達到殺滅菌目的.本實驗數(shù)據(jù)表明黃芩水提物可破壞菌體細胞膜的完整性，造成細胞內(nèi)離子及小分子物質(zhì)外漏，即黃芩水提物可通過破壞嗜水氣單胞菌細胞膜完整性和通透性實現(xiàn)抑菌作用.

2.5 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌細胞壁的影響

AKP是位于細胞壁與細胞膜之間的一種酶，在細胞結(jié)構(gòu)完整時胞外含量極低.而當(dāng)細胞壁受損后，AKP將大量泄漏到胞外，作為判斷細胞壁完整性的指標(biāo).黃芩水提物作用于嗜水氣單胞菌后AKP含量變化如圖3所示.未經(jīng)處理的對照組，菌液中的AKP含量約為1 U/L，且在整個培養(yǎng)周期中沒有發(fā)生明顯變化.而添加了不同濃度的黃芩水提物后，菌液中AKP含量均明顯增高，且隨著藥液濃度的增高而增高，同時隨著作用時間的延長亦增加.當(dāng)作用時間到達6 h后，AKP含量基本趨于穩(wěn)定.

圖3 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌菌液堿性磷酸酶含量的影響

研究表明，中草藥可抑制細胞壁黏肽生成，增加其通透性使內(nèi)容物外泄；謝麗玲等[22]發(fā)現(xiàn)黃芩醇提物破壞副溶血性弧菌細胞壁而使其裂解死亡.Zhou等[23]發(fā)現(xiàn)樟樹葉提取出的松脂醇可破壞銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的細胞膜和細胞壁，使可溶性糖和蛋白質(zhì)泄漏而抑制其生長.

由圖3可見嗜水氣單胞菌懸液的AKP值在不同黃芩水提物處理后均明顯增加，說明黃芩水提物對嗜水氣單胞菌的細胞壁可產(chǎn)生一定破壞作用，使AKP滲出，導(dǎo)致菌懸液中的AKP含量增加；這與前述電導(dǎo)率的實驗結(jié)果一致.

2.6 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌胞外蛋白質(zhì)含量的影響

黃芩水提物作用于嗜水氣單胞菌后對胞外蛋白含量的影響曲線如圖4所示.可以發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何處理的對照組中，菌體培養(yǎng)液上清中的胞外蛋白質(zhì)含量較低，約為0.5 mg/mL，且隨著培養(yǎng)時間的推移未出現(xiàn)明顯變化.而當(dāng)在培養(yǎng)基中添加了不同濃度的黃芩水提物后，嗜水氣單胞菌胞外蛋白含量較對照組顯著增加，且隨著培養(yǎng)時間的延長，胞外蛋白含量隨之增加，同時還呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，即所添加的黃芩水提物濃度越高，胞外蛋白含量越高.結(jié)果進一步表明黃芩水提物可能破壞了菌體細胞膜和細胞壁的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白外漏，使得胞外蛋白含量增加.也可能直接影響蛋白質(zhì)合成，從而影響遺傳物質(zhì)合成(包括DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄).此外，中草藥還可抑制細菌相關(guān)酶活性及外排泵的功能；抑制細菌的呼吸代謝等來實現(xiàn)抑菌作用.

圖4 黃芩水提物對嗜水氣單胞菌蛋白質(zhì)含量的影響

3 結(jié)論

嗜水氣單胞菌作為一種水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要病原菌，不僅直接影響我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，還可以通過食用水產(chǎn)品威脅到人類健康.目前，對于嗜水氣單胞菌病害的防治主要采用傳統(tǒng)抗生素的手段，但抗生素的長期使用甚至濫用，導(dǎo)致了水產(chǎn)品藥物殘留嚴(yán)重超標(biāo)，長此以往，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌產(chǎn)生耐藥性.

我國中草藥資源豐富，種類繁多.中草藥提取物為天然物質(zhì)，毒副作用下，不易出現(xiàn)耐藥性.本文選取黃芩、烏梅、野菊花、鳳尾草作為研究對象，分別采用水提法和醇提法進行了提取物的制備，采用濾紙片平皿擴散法測定其對嗜水氣單胞菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)四種中草藥提取物均具有較好的抑菌活性，其中黃芩提取物抑菌效果最為顯著，確定黃芩水提物MIC為0.125 g/mL，醇提物MIC為0.25 g/mL，并選取黃芩水提物進行了抑菌機制的初步探討.

從細胞膜、細胞壁、蛋白質(zhì)含量對黃芩水提物對嗜水氣單胞菌的抑菌機制進行了初探，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過黃芩水提物處理后，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率和總漏出率均升高，而電導(dǎo)率和總漏出率可以作為檢測細胞膜完整性的指標(biāo)，試驗結(jié)果表明黃芩水提物能夠影響嗜水氣單胞菌的細胞膜通透性，使胞內(nèi)離子等內(nèi)容物外流，破壞細胞膜的完整性.堿性磷酸酶和蛋白質(zhì)含量均增加，表明黃芩水提物破壞了嗜水氣單胞菌細胞壁的完整性.本文結(jié)果表明黃芩水提物對于嗜水氣單胞菌的抑菌作用主要通過作用于細胞膜、細胞壁等靶點實現(xiàn)，對于開發(fā)新型安全的抗菌藥物具有重要的理論指導(dǎo)價值.