呂嘉櫪， 晁倩文， 劉秉坤， 羅 瀟

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

泡菜是不同蔬菜經(jīng)多菌群微生物發(fā)酵而成的發(fā)酵食品，不同地域條件、發(fā)酵方式、原輔料等對(duì)菌群均有一定影響，進(jìn)而對(duì)其風(fēng)味和質(zhì)量產(chǎn)生影響[1].因此，對(duì)泡菜菌群的研究具有重要的理論與實(shí)際意義.目前，對(duì)泡菜中菌群的研究大多集中在細(xì)菌方面，主要通過(guò)傳統(tǒng)分離方法、通量測(cè)序法和PCR-DGGE等方法，研究細(xì)菌群落組成、優(yōu)勢(shì)菌群及其與產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)系[2-8].泡菜中乳酸菌種類(lèi)及含量直接影響到泡菜的質(zhì)量，發(fā)酵過(guò)程中乳酸積累導(dǎo)致壇內(nèi)pH降低，從而抑制一些腐敗菌的生長(zhǎng)[9,10]，而且乳酸菌對(duì)于發(fā)酵泡菜的品質(zhì)形成發(fā)揮多重作用，如增進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善食品風(fēng)味等，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的提高起到了重要作用[11-19].

但是，傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵的菌群除了細(xì)菌的主要作用以外，還有其他菌群的參與.已有研究報(bào)道，在泡菜發(fā)酵前期或取樣和加樣導(dǎo)致的發(fā)酵壇內(nèi)氧分壓較大時(shí)，有利于酵母菌的生長(zhǎng)，且發(fā)酵過(guò)程中的有益酵母菌有利于泡菜品質(zhì)和風(fēng)味的形成，影響產(chǎn)品的質(zhì)地和儲(chǔ)藏[20],但是酵母菌較多時(shí)，泡菜感官明顯降低[21].

例如，高術(shù)杰[22]對(duì)人工發(fā)酵蔬菜的研究進(jìn)展進(jìn)行分析，論述了泡菜中酵母菌的研究進(jìn)展，結(jié)果表明，發(fā)酵前期酵母菌屬主要為異常漢遜酵母、德式酵母、羅斯酵母等，隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，酵母菌成倍增長(zhǎng)；孟霞等[23]采用18S rDNA對(duì)青菜泡菜樣品真菌菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)德巴利世酵母和假絲酵母在發(fā)酵前期占主要優(yōu)勢(shì).近期，李恒等[2]采用高通量測(cè)序方法分析了連續(xù)發(fā)酵20代泡菜母水真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，結(jié)果表明釀酒酵母屬和假絲酵母屬為主要的優(yōu)勢(shì)菌，其中釀酒酵母屬隨著連續(xù)發(fā)酵次數(shù)的增加豐度由91%上升至99%.可見(jiàn)，泡菜中真菌種群的顯著差異直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量及其安全性等[24,25].張勇等[26]采用26S rDNA對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵漿水中酵母菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明主要有地霉屬、畢赤酵母屬、阿氏絲孢酵母、解脂假絲酵母、伊薩酵母.

因此，本研究為揭示陜西西安地區(qū)市售泡菜產(chǎn)品中真菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性，以具有代表性的市售傳統(tǒng)老壇自然發(fā)酵泡菜為試驗(yàn)樣品，采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)，分析其真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，為進(jìn)一步研究泡菜發(fā)酵過(guò)程中真菌菌群結(jié)構(gòu)對(duì)其質(zhì)量及其安全性的影響奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試樣品

通過(guò)前期工作對(duì)在西安不同地區(qū)采集的30個(gè)泡菜樣品中的菌群形態(tài)的顯微觀察和感官評(píng)定，本研究試驗(yàn)樣品的選取是根據(jù)樣品中菌群形態(tài)多樣性、采樣地點(diǎn)分布、配方中的蔬菜主料和添加的輔料組成以及感官等方面，選取了其中的5種泡菜樣品.其編號(hào)及配方如表1所示.

表1 五種市售傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品

1.2 試劑

FastDNASpin Kit for Soil試劑盒：Mpbio公司；AxyPrepDNA試劑盒：AXYGEN公司；2×TaqPCR MasterMix染料：Biomed公司；NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit試劑盒：NEB； AMPureXP試劑盒：Beckman Coulter公司；Agilent DNA 1000 Kit試劑盒：KAPA；HT DNA-Extended Range LabChip試劑盒：PerkinElmer；MiSeqReagent Kit v3 (600 cycle)(PE300)試劑盒：Illumina；MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle)試劑盒：Illumina.

1.3 儀器與設(shè)備

高通量二代測(cè)序儀,MiSeq，illumina公司；凝膠成像分析系統(tǒng),JY04S-3C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；核酸電泳儀,JY600C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；冷凍離心機(jī),5430R，Eppendorf公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析：分別采用PCR擴(kuò)增ITS1(ITS 1-ITS 2)區(qū)基因片段并進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序分析真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性.

1.4.1 基因組DNA的抽提

采用基因組提取試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)，提取樣品總DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè).

1.4.2 PCR擴(kuò)增及Illumina測(cè)序

對(duì)樣品基因組擴(kuò)增ITS1(ITS1-ITS2)區(qū)，引物序列為5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′.

25μLPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA樣品X(30 ng)，F(xiàn)orward Primer(5 uM)1μL，Reverse Primer(5 uM)1μL ，BSA(2 ng/μL)3μL，2xTaqPlus Master Mix 12.5μL，ddH2O (7.5-X)μL.

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸7 min，4 ℃保溫.每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

PCR產(chǎn)物合并：參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合.

Miseq文庫(kù)構(gòu)建及Miseq測(cè)序：將合并的PCR產(chǎn)物按照建庫(kù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行文庫(kù)制備，針對(duì)已構(gòu)建文庫(kù)，用試劑盒進(jìn)行Miseq測(cè)序.

1.4.3 生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)Miseq測(cè)得的fq數(shù)據(jù)根據(jù)PE測(cè)序的overlap關(guān)系將成對(duì)的序列拼接(merge)成一條序列.同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量及拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向.用usearch按照97%相似性序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)(不含單序列)[27,28]，得到代表序列再將其全部序列按照97%相似度map到OTU上形成OTU列表.進(jìn)一步對(duì)微生物測(cè)序進(jìn)行深度分析，并依次在kingdom(界) 、phylum(門(mén))、class(綱) 、order(目) ，family(科) 、genus(屬) 、species(種) 分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)各個(gè)發(fā)酵蔬菜樣品的群落組成(α群落結(jié)構(gòu)多樣性)，包括計(jì)算Chao，Ace，Shannon，Simpson指數(shù)，分析細(xì)菌群落豐度和群落結(jié)構(gòu)多樣性并計(jì)算Coverage評(píng)估測(cè)序深度[29]；根據(jù)多個(gè)樣本中所共有及特有的OTU數(shù)目，繪制韋恩圖，并結(jié)合屬水平上的菌群組成柱狀圖、核心屬分布熱圖、屬水平下樣本聚類(lèi)樹(shù)與柱狀圖組合分析圖，分析菌群的群落結(jié)構(gòu)多樣性[29].

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

分別對(duì)5種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品的總基因組進(jìn)行提取，并針對(duì)ITS1(ITS1-ITS2)區(qū)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)不同測(cè)序數(shù)據(jù)類(lèi)型選用不同的參考數(shù)據(jù)庫(kù)用usearch軟件去除嵌合體，通過(guò)mothur去掉長(zhǎng)度較小的tags;首先對(duì)測(cè)得的fq數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，過(guò)濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的read；然后根據(jù)PE測(cè)序的overlap關(guān)系將成對(duì)的序列拼接(merge)成一條序列.其每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示.

圖1 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品真菌基因組PCR產(chǎn)物電泳圖

由圖1可知，五種樣品在250～500 bp對(duì)應(yīng)的位置都有清晰的條帶，證明PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性提供了保障.

2. 2 真菌群落α-群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

通過(guò)單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性[29]，其中Chao1即菌種豐富度指數(shù)，用以估計(jì)群落中的OTU數(shù)目.五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品真菌群落α-群落結(jié)構(gòu)多樣性分析見(jiàn)表2所示.

表2 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)

由表2可知，測(cè)試的五種樣品，測(cè)序深度均在0.993以上，能夠代表各樣品中真菌種群的真實(shí)情況.真菌菌群落群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)(OTUs、Chao、Shannon)對(duì)比表現(xiàn)出明顯的差異，結(jié)果為HBZ1樣品的菌群豐度指數(shù)最高，其次是HBZ2和LHL2，樣品LHL5、LHL6的菌群豐度指數(shù)最低.表明HBZ1樣品中真菌菌群較多，HBZ2、LHL2次之，LHL5、LHL6較少.

2.3 OTUs統(tǒng)計(jì)及分類(lèi)學(xué)分析

OTU(Operational Taxonomic Units)通常對(duì)97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析.本實(shí)驗(yàn)對(duì)五種樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)總共得到580個(gè)OTUs，樣品共有OTU 165個(gè)，分為7個(gè)門(mén)、22個(gè)綱、62個(gè)目、118個(gè)科、178個(gè)屬、321個(gè)種.

2.4 樣品OTU分布Venn圖

Venn圖[30]可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，可以比較直觀的表現(xiàn)環(huán)境樣本的OTU數(shù)目組及其樣本或分組之間的重疊情況.分析五種樣品共有OTU，采用R語(yǔ)言工具統(tǒng)計(jì)和作圖繪制OTU分布Venn圖，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，五種樣品共有OUT 165個(gè)，兩兩樣品間也存在共同的OTU.其中HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6特有OTU分別為10、6、9、5、2個(gè).

圖2 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品OTU分布Venn圖

2.5 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品真菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，可以得知一個(gè)或多個(gè)樣本在各分類(lèi)水平上的分類(lèi)學(xué)比對(duì)情況.因此，可以使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，觀測(cè)樣本在不同分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)[31].采用R語(yǔ)言作圖工具，本文從門(mén)、綱、目、科、屬等五個(gè)水平上作柱狀圖，五種樣品在不同水平上的真菌組成結(jié)果如圖3～7所示.

在門(mén)分類(lèi)水平上，五種樣品共注釋到明確地位的7個(gè)門(mén)的真核微生物，分別是Ascomycota(子囊菌門(mén))、Chytridiomycota(壺菌門(mén))、Glomeromycota(球囊菌門(mén))、Rozellomycota、Basidiomycota(擔(dān)子菌門(mén))、Olpidiomycota、Mortierellomycota(鞭毛菌門(mén)).優(yōu)勢(shì)菌占比情況如圖3所示，其中Ascomycota占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6中的豐度依次是82.72%、85.76%、89.16%、90.89%、77.32%，其次是Basidiomycota，在各樣品中的豐度依次是9.83%、6.34%、8.65%、8.50%、20.24%.由檢測(cè)結(jié)果可知，五種樣品中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群均為Ascomycota(子囊菌門(mén))，而HBZI和HBZ2菌群種類(lèi)差別不大，說(shuō)明在門(mén)水平上五種樣品的菌群豐富度差別不是很顯著.而李恒等[2]對(duì)四川地區(qū)泡菜研究結(jié)果表明，在泡菜發(fā)酵過(guò)程中，真菌群落在門(mén)水平上的變化規(guī)律為，Ascomycota占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，所占比例在達(dá)到99%以上，是泡菜中主要真菌群類(lèi)，這與本文的研究結(jié)果較為相似.但是還有不足1%的其他門(mén)的真菌與本研究結(jié)果有一定差異，可能是地域、原輔料等不同所致.

圖3 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品在門(mén)的水平上的真菌組成

在綱分類(lèi)水平上，五種樣品共注釋到明確地位的22個(gè)綱，還有未鑒定到綱水平的OTU.占比情況如圖4所示.其中Saccharomycetes(酵母綱)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6中的豐度依次是39.12%、37.77%、74.45%、87.51%、60.29%；其次Sordariomycetes(糞殼菌綱)占優(yōu)勢(shì)，在上述各樣品中的豐度依次是26.87%、31.39%、4.93%、1.56%、6.28%；Agaricomycetes(傘菌綱)占比僅次于Sordariomycetes，在各樣品中的豐度依次為8.65%、5.18%、7.94%、3.26%、19.43%.此外還檢測(cè)到豐度較低的其他綱的真菌等.表明五種樣品在綱水平上的優(yōu)勢(shì)菌群較為相似，而在LHL2、LHL5和LHL6中菌群相對(duì)較少，且酵母菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這可能主要是由于其中加入了花椒、白酒等輔料，且依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[32]可知，花椒、白酒等具有一定的抑菌作用，導(dǎo)致樣品中菌群種類(lèi)減少.

圖4 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品在綱的水平上的真菌組成

在目分類(lèi)水平上，注釋到明確分類(lèi)地位的有62個(gè)目，占比情況如圖5所示.其中Saccharomycetales(酵母菌目)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6中的豐度依次是39.12%、37.77%、74.45%、87.51%、60.29%；Hypocreales(竹蓋菌目)占優(yōu)勢(shì)，在上述各樣品中的豐度依次為17.12%、18.98%、3.35%、0.51%、4.43%；Thelephorales(革菌目)在LHL6中的豐度較高，為17.76%，在HBZ1中豐度為6.13%，在HBZ2中豐度為2.20%、在LHL2中的豐度為5.95%、在LHL5中的豐度為2.08%.Helotiales(柔膜菌目)在上述各樣品中的豐度分別為3.03%、2.98%、4.61%、0.91%、5.16%；Pleosporales(隔孢腔菌目)所占豐度依次為3.47%、3.79%、2.25%、0.40%、1.53%；Sordariales(糞殼菌目)所占豐度依次是2.68%、3.22%、0.49%、0.04%、0.87%；由上述分析結(jié)果可知，HBZ1和HBZ2樣品中菌群結(jié)構(gòu)較相似，菌群結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，其主要原因是樣品HBZ1中的輔料較多，這些輔料對(duì)菌群有促生長(zhǎng)作用，樣品HBZ2中的原料較多，除了蓮花白以外，還加入了白蘿卜和紅蘿卜，對(duì)菌群均有促生長(zhǎng)作用.而LHL2、LHL5和LHL6中菌群豐富度相對(duì)較低，其中LHL5中菌群最少，因該樣品中加入了花椒、紅辣椒、雞精這幾種輔料，有資料表明，這幾種輔料均有一定的抑菌性[32].

圖5 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品在目的水平上的真菌組成

在科分類(lèi)水平上，被注釋到明確分類(lèi)地位的有118個(gè)科，占比情況如圖6所示.其中Saccharomycetaceae(酵母菌科)在HBZ1、LHL2、LHL6占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，豐度分別為30.14%、57.78%、56.24%，在LHL5中占優(yōu)勢(shì)，豐度為28.70%；Dipodascaceae(雙足囊菌科)在HBZ2、LHL2、LHL5中占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為 10.17%、13.22%、28.80%；Pichiaceae(畢赤酵母科)在HBZ2中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，豐度為26.37%，在HBZ1中占優(yōu)勢(shì)，豐度為6.02%；Thelephoraceae(革菌科)在各樣品中占優(yōu)勢(shì)，在HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6中的豐度依次是6.13%、2.20%、5.95%、2.08%、16.48%；Saccharomycetales fam Incertae sedis(釀酒酵母科)在LHL5中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，豐度為24.79%；Nectriaceae(從赤殼科)在HBZ1、HBZ2中占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為10.49%、11.54%；由上述分析結(jié)果可知，在科水平上，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的為酵母菌科，但是在不同樣品中豐度均不相同，其他科的真菌在不同樣品中的豐度不盡相同，這與樣品的主輔料成分有關(guān).

圖6 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品在科的水平上的真菌組成

在屬分類(lèi)水平上，被注釋到明確分類(lèi)地位的有178個(gè)屬，占比情況如圖7所示，核心屬及其分類(lèi)水平heartmap圖如圖8所示.其中Saccharomyces(酵母屬)在HBZ1、LHL2、LHL5、LHL6中的豐度分別為29.82%、27.04%、27.79%、51.95%；Dipodascus(雙足囊菌屬)在LHL2、LHL5中占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為5.79%、28.67%；Issatchenkia(伊薩酵母屬)在LHL2、LHL5、LHL6中占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為30.73%、0.91%、4.30%；Pichia(畢赤酵母屬)在HBZ1 、HBZ2中占優(yōu)勢(shì)，豐度分別為6.02%、26.37%；Tomentella(革菌屬)在各樣品中的豐度分別為5.65%、1.78%、4.63%、2.00%、15.85%.Candida(念珠菌屬)在LHL5中的豐度為24.79%；Fusarium(鐮刀菌屬)在HBZ1 、HBZ2中的豐度分別為6.88%、7.33%；表明在樣品HBZ1、LHL2、LHLHL5和LHL6中的優(yōu)勢(shì)菌群仍然是酵母菌屬，而在LHL2中并未檢測(cè)到酵母菌屬，這主要是LHL2中的原料與其余四種樣品差異較大造成的，而其余優(yōu)勢(shì)菌群與科水平鑒定結(jié)果較為相似.

圖7 五種傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品在屬的水平上的真菌組成

圖8顯示了五種樣品屬水平下樣本聚類(lèi)樹(shù)與柱狀圖的組合分析情況.由圖8可知，在屬水平，左側(cè)的聚類(lèi)結(jié)果一致，分為三大枝，其中HBZ1與HBZ2聚在一枝， LHL2、LHL5聚在同一枝，LHL6為一枝，說(shuō)明HBZ1與HBZ2真菌組成在屬水平上較為相似，LHL2、LHL5真菌組成在屬水平上較為相似.

圖8 真菌屬水平下樣本聚類(lèi)樹(shù)與柱狀圖組合分析圖

Heatmap[33]可以用顏色變化來(lái)反映物種或樣本間豐度相似性聚類(lèi)，將聚類(lèi)后數(shù)據(jù)表示在heatmap圖上，采用R語(yǔ)言vegan包，vegdist和hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類(lèi)分析；得到五種樣品真菌核心屬及其分類(lèi)水平heartmap圖如圖9所示.圖9中每一行代表不同的屬，不同的顏色代表豐度不同，其中從藍(lán)色到紅色所代表的豐度值逐漸增加.從圖9可以明顯看出，不同真菌屬在各樣品中所占豐度不同.其中，Pichia畢赤酵母樣品HBZ2中豐度較高，而Dipodascus(雙足囊菌屬)和Candida(念珠菌屬)樣品LHL5中豐度較高，而Kazachstnia(哈薩克斯坦酵母)在HBZ1、LHL2、LHL5和LHL6中豐度較高，Issatchenkia(伊薩酵母屬)在LHL2豐度較高，Tomentella(革菌屬)在LHL6中豐度相對(duì)較高，而在其他四種樣品中豐度較低.這說(shuō)明樣品不同，其在屬水平真菌核心屬差別還是比較顯著.

圖9 真菌核心屬及其分類(lèi)水平heartmap圖

3 結(jié)論

采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)分析，研究了陜西省西安地區(qū)市售傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜樣品HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6的真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，結(jié)果共鑒定出了178屬真菌.采樣地點(diǎn)和原輔料不同對(duì)真菌菌群結(jié)構(gòu)均有一定的影響.五種樣品真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著差異，但其中的優(yōu)勢(shì)真菌均為酵母菌， 70%以上的真菌在各樣品中的豐度分別為，HBZ1中Saccharomyces(酵母屬)29.82%、Pichia(畢赤氏酵母屬)6.02% 、Fusarium(鐮刀菌屬)6.88%、Tomentella(革菌屬)5.65%；HBZ2中Pichia(畢赤氏酵母屬)26.37% 、Fusarium(鐮刀菌屬)7.33% 、Tomentella(革菌屬)1.78%；LHL2Saccharomyces(釀酒酵母屬)27.04%、Dipodascus(雙足囊菌屬)5.79% 、Issatchenki(伊薩酵母屬)30.73%、Tomentella(革菌屬)4.63%；LHL5 中Saccharomyces(釀酒酵母屬)27.79% 、Dipodascus(雙足囊菌屬)28.67%、Issatchenki(伊薩酵母屬)0.91%、Candida(念珠菌屬)24.79%Tomentella(革菌屬)2.00%；LHL 6中Saccharomyces(釀酒酵母屬)51.95% 、Issatchenki(伊薩酵母屬)4.30%、Tomentella(革菌屬)15.85%.