林欣雨，李瑤琦，周 瑾，羅 超

（紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，浙江 紹興312000）

微球是指藥物分散或被吸附在高分子、聚合物基質(zhì)中而形成的微粒分散體系，可提高穩(wěn)定性，降低刺激性，控制釋放，并具有被動靶向性，是現(xiàn)代藥物傳遞系統(tǒng)的主要載體形式之一［1］。目前，制備微球的方法主要有相轉(zhuǎn)變法［2］、乳化交聯(lián)法［3］、噴霧干燥法［4］、膜乳化法等，其中膜乳化法以無機(jī)微孔膜（SPG）為介質(zhì)，利用膜微孔分離和毛細(xì)管作用原理，通過在膜一側(cè)施加壓力使分散溶液透過膜孔，以微小液滴的形式分散在與其不相溶的溶液中而形成乳液［5］，從而交聯(lián)固化形成微球，該方法反應(yīng)條件溫和，操作簡便，易于規(guī)模化生產(chǎn)，重復(fù)性好。

殼聚糖是自然界存儲量僅次于纖維素的天然高分子多糖，由蝦、蟹等甲殼動物外殼的甲殼素脫乙?；茫?］，具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性，是組織工程材料和藥物緩控釋載體材料的主要基質(zhì)成分［7-8］，可制成微球［3］、納米粒［9］、水凝膠［10］、微凝膠［11］等多種不同特性的材料。殼聚糖微球可通過包覆［4］、吸 附［3］、共聚［12］等多種手段負(fù)載藥物，并具有理想的緩控釋性能、黏膜粘附性，可提高藥物在體液環(huán)境中的穩(wěn)定性和生物利用度。本實驗采用SPG 膜乳化法制備殼聚糖／鹽酸小檗堿緩釋微球，并優(yōu)化制備工藝，表征理化特性，研究緩釋性能，以期為相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料

殼聚糖（脫乙酰度95%，分子量1.2×105，浙江澳興生物技術(shù)有限公司）；鹽酸小檗堿原料藥（含有量＞98%，鄭州豐冠化工產(chǎn)品有限公司）；鹽酸小檗堿對照品（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號200351-161107）；司盤-80（上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）。戊二醛（東京仁成工業(yè)株式會社）。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

Waters e2695-2489型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Nicolet 740型紅外光譜儀（美國Thermo 公司）；X’Pert PRO 型X 射線衍射儀（荷蘭PNAlytical 公司）；JSM-6360LV 型掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）；FD-1 A-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；高效手動膜乳化器（日本SPG Technology 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 微球制備 將1 g 殼聚糖溶于50 mL 2%醋酸中，配制成2%溶液，在一定溫度下將200 mg 鹽酸小檗堿溶于其中，持續(xù)攪拌一定時間，作為水相，并以10倍體積液體石蠟-環(huán)己烷（7 ∶5）混合液為油相，2%司盤-80為乳化劑。在相同溫度下，通過50 μm SPG 膜乳化器將水相壓入到油相中，形成W／O 型乳液，再加入一定量戊二醛交聯(lián)1 h，離心收集微球，分別用乙醇、純水洗滌，真空冷凍干燥，即得。

2.2 含有量測定

2.2.1 色譜條件 SunFire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.5% 磷酸（30 ∶70，三乙胺調(diào)pH 至3）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長345 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10 mg，蒸餾水溶解并定容于100 mL 棕色量瓶中，配制成0.1 g／L，蒸餾水進(jìn)一步稀釋至1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg／L，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積積分值（Y）對溶液質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y=6 139.2X-3 897.2（R2=0.999 9），在1～20 mg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗 1.0、10.0、20.0 mg／L 鹽酸小檗堿對照品溶液在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，在同1 d 內(nèi)重復(fù)6次，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 分別為1.1%、2.0%、1.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 10.0 mg／L 鹽酸小檗堿對照品溶液于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為1.1%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 配制含鹽酸小檗堿9.6、9.3、9.7、10.5、10.6、10.2 mg／L 的載藥微球溶出樣品溶液10 mL，加入對照品溶液（含10.0 mg／L鹽酸小檗堿）10 mL，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得平均加樣回收率為99.12%，RSD為1.53%。

2.2.6 專屬性考察 制備鹽酸小檗堿對照品溶液、鹽酸小檗堿原料藥溶液、空白殼聚糖微球浸出液、載藥殼聚糖微球浸出液（釋放度檢測樣品），在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。由圖可知，載體材料對鹽酸小檗堿檢測沒有影響，該方法專屬性良好。

圖1 鹽酸小檗堿HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of berberberine hydrochloride

2.3 包封率、載藥量測定 取適量載藥微球加到甲醇中，密封超聲1 h，10 000 r／min 離心30 min以使鹽酸小檗堿全部溶出，上清液加甲醇定容到100 mL，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，按下式計算載藥量、包封率。

2.4 制備工藝優(yōu)化［13］根據(jù)預(yù)實驗（單因素試驗）結(jié)果，選擇對載藥微球制備影響較大的交聯(lián)劑用量（X1）、混合攪拌時間（X2）、體系溫度（X3）作為影響因素，包封率（Y）作為評價指標(biāo)，星點設(shè)計-效應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。再通過Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行擬合，得到回歸方程為方差分析見表2。

表1 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

由表2可知，模型P=0.000 6＜0.05，表明其穩(wěn)定可靠；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.955 4，表明模型擬合度良好，能準(zhǔn)確預(yù)測實際情況；校正決定系數(shù)=0.898 0，表明模型能解釋89.80% 響應(yīng)值的變化；各因素失擬項P＞0.05，表明擬合方程準(zhǔn)確性良好；各因素影響程度依次為X2＞X3＞X1，X2、X3、X2X3、有顯著影響（P＜0.05）。

響應(yīng)面分析見圖2。通過Design-Expert 8.0.6.1軟件，得到最優(yōu)工藝為交聯(lián)劑用量8.23 mL，混合攪拌時間111.63 min，體系溫度43.72 ℃，包封率82.00%，考慮到實際可操作性，將其修正為交聯(lián)劑用量8 mL，混合攪拌時間112 min，體系溫度44 ℃。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Respone surface plots for various factors

然后，按照優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗證試驗，結(jié)果見表3，可知包封率與預(yù)測值82.00%相當(dāng)（相對誤差1.67%），表明工藝穩(wěn)定可行，模型預(yù)測性良好。

表3 驗證試驗結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of verification tests（n=3）

2.5 微球表征

2.5.1 掃描電子顯微鏡（SEM）取適量微球均勻鋪在粘有導(dǎo)電膠的銅塊表面，噴金處理后進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖3。由圖可知，微球呈規(guī)則球形，表面較光滑，大部分粒徑在50 μm 左右。

圖3 微球SEM 圖Fig.3 SEM images for microspheres

2.5.2 傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）KBr 將鹽酸小檗堿、殼聚糖微球、載藥微球、物理混合物分別壓片，在4 000～400 cm-1處測定紅外光譜，結(jié)果見圖4。由圖可知，鹽酸小檗堿1 623、1 503 cm-1附近是芳環(huán)骨架振動帶［14］；殼聚糖微球除了殼聚糖特征峰（如3 400 cm-1的O-H 和N-H 伸縮振動峰，1 573 cm-1的 N-H 面內(nèi)彎 曲振動 峰，1 046 cm-1的C-O 伸縮振動峰）［15］外，還有因戊二醛交聯(lián)而引入的C-H 伸縮振動峰2 941 cm-1（-CH3）和2 865 cm-1（-CH2）；物理混合物可見明顯的鹽酸小檗堿、殼聚糖微球特征峰疊加；載藥微粒除了608 cm-1處有鹽酸小檗堿特征峰外，其余特征峰明顯減弱，表明微球?qū)崿F(xiàn)了殼聚糖對鹽酸小檗堿的包覆，使后者較好地分散在微球內(nèi)部。

2.5.3 X 射線衍射分析（XRD）圖5顯示，鹽酸小檗堿在18.29°、25.83°、28.64°，35.42°處有尖銳、狹窄的衍射峰，顯示出典型晶體結(jié)構(gòu)［14］；殼聚糖微球只在17°附近有1個較寬的特征峰；載藥微球除了26°附近有1個較弱的鹽酸小檗堿特征峰外，其余均被殼聚糖微球特征圖譜掩蓋；物理混合物可見明顯的鹽酸小檗堿、殼聚糖微球特征峰疊加，表明微球較好地包覆了鹽酸小檗堿。

圖4 樣品FT-IR 圖Fig.4 FT-IR spectra for samples

圖5 樣品XRD 圖Fig.5 XRD patterns for samples

2.6 體外釋放行為考察 以0.1 mol／L 鹽酸（pH=1.2）、磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）為溶出介質(zhì)，取相當(dāng)于鹽酸小檗堿質(zhì)量100 mg 的載藥微球，分散于5 mL 溶出介質(zhì)后裝入透析袋內(nèi)（截留分子量10 000 Da），置于95 mL 相同溶出介質(zhì)中，（37± 0.5）℃恒溫水浴振蕩（100 r／min），于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h 各取樣2 mL，并補(bǔ)充相同體積空白介質(zhì)，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算累積釋放率Q，公式為其中W為鹽酸小檗堿投入量，Cn為第n個取樣點溶液質(zhì)量濃度，Ci為第n-1個取樣點溶液質(zhì)量濃度，V為溶出介質(zhì)總體積，Vi為取樣體積。結(jié)果見圖6。

由圖可知，微球在2種釋放介質(zhì)中顯示出良好的緩釋性能，其中在0.1 mol／L 鹽酸（pH=1.2）中釋放更慢，24 h 內(nèi)累積釋放率僅為77.8%，而在磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）中達(dá)85.7%。同時，均未出現(xiàn)明顯突釋現(xiàn)象，0.5 h 內(nèi)釋放率分別為4.8%、5.3%。

圖6 微球體外釋藥曲線Fig.6 In vitro drug release curves for microspheres

2.7 釋放動力學(xué)模型擬合 將微球體外釋放數(shù)據(jù)分別以零級、一級、Higuchi、Ritger-Peppas 模型進(jìn)行擬合［16］，結(jié)果見表4。由表可知，微球在2種釋放介質(zhì)中均與Peppas 模型擬合度最高，n分別為0.789 2、0.778 9，屬于non-Fickian 擴(kuò)散［17］。

表4 微球模型擬合結(jié)果Tab.4 Results of model fitting of microspheres

3 討論

中藥單體活性成分的開發(fā)與利用是中醫(yī)藥走向現(xiàn)代化、國際化的重要基礎(chǔ)，近幾十年來青蒿素、小檗堿、穿心蓮內(nèi)酯、川芎嗪等一大批中藥活性單體成分已成為臨床一線用藥，并受到國際學(xué)界高度關(guān)注［18］。然而，穩(wěn)定性差、溶解度低等問題一直困擾著大部分中藥單體活性成分的開發(fā)利用，如丹參酮ⅡA 在水中的溶解度僅為2.8 ng／mL，半衰期僅為1～2 h［19］，雖然納米粒、脂質(zhì)體、微球等現(xiàn)代制劑技術(shù)可在一定程度上克服這些困擾［20］，但穩(wěn)定性、溶解度問題依然突出。

生物堿是一類含氮的堿性有機(jī)化合物，是中藥單體活性成分的重要組成部分，小檗堿、阿托品、茶堿、毛果蕓香堿等已廣泛應(yīng)用與臨床［21］。但大多數(shù)生物堿幾乎不溶或難溶于水，導(dǎo)致其很難與親水性基質(zhì)的水溶液共混制備藥物載體，只能以毒性相對較高的疏水性基質(zhì)或價格較高的兩親性基質(zhì)作為載體。

殼聚糖是一種廉價易得、性能優(yōu)越的親水性藥物緩控釋載體基質(zhì)材料，其分子中含有游離氨基，在酸性溶液中易成鹽，呈陽離子性質(zhì)，在酸性環(huán)境中的溶解度高于在中性環(huán)境中［22］，與生物堿的溶解特性相似，常用稀鹽酸或稀醋酸作為溶劑，其酸性溶液可促進(jìn)生物堿溶解，有利于后者與其共混制備各類藥物載體。SPG 膜乳化技術(shù)制備殼聚糖微球技術(shù)成熟，操作簡便，制備條件溫和，無需高溫高壓，不會破壞藥物成分，而且載藥量高，易于規(guī)模化生產(chǎn)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，殼聚糖／鹽酸小檗堿緩釋微球的最優(yōu)制備工藝為交聯(lián)劑用量8 mL，混合攪拌時間112 min，體系溫度44 ℃，包封率80.6%，載藥量13.89%；微球在體外模擬胃液（pH=1.2）、腸液（pH=7.4）中都具有良好的緩釋性能，持續(xù)釋藥時間超過24 h，釋放均符合Peppas 模型和non-Fickian 擴(kuò)散。由此可知，該微球可提高生物堿類成分在體液環(huán)境中的穩(wěn)定性，并能減緩血藥濃度波動，降低給藥頻率，提高生物利用度，為相關(guān)緩控釋制劑研發(fā)提供實驗依據(jù)。