許 偉

（東營市食品藥品檢驗(yàn)中心，山東 東營257091）

寧神定志丸收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第三冊）》［1］，是由遠(yuǎn)志、黨參、石菖蒲、茯苓4味藥材加工而成的中成藥復(fù)方制劑，具有益氣安神、交通心腎、明目等功效，主要用于神志不寧、驚悸健忘、失眠，倦怠、視力減退等病癥的治療，療效顯著，但其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對性狀進(jìn)行規(guī)定，未涉及成分定性鑒別或定量測定。

一測多評法通過測定復(fù)方制劑中對照品穩(wěn)定、價(jià)格低廉的1種成分，利用中藥成分之間存在的函數(shù)關(guān)系來實(shí)現(xiàn)多種成分同時(shí)測定，可有效降低檢驗(yàn)成本，提高檢測結(jié)果穩(wěn)定性，廣泛應(yīng)用于中藥材及中藥制劑質(zhì)量分析中。因此，本實(shí)驗(yàn)采用一測多評法，以3，6′-二芥子酰基蔗糖為內(nèi)標(biāo)，建立其與遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、黨參炔苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸之間的相對校正因子，測定寧神定志丸中各成分含有量，以期驗(yàn)證所建立方法的可行性和準(zhǔn)確性。

1 材料

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；MS104TS 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-250DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。寧神定志丸（每袋9 g，批號170902、180201、180403）購自廣西梧州制 藥（集團(tuán)）股份有限公司。遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ（111850-201705，含有量96.5%）、3，6′-二芥子?；崽牵?11848-201604，含有量 96.7%）、黨參炔苷（111732-201607，含有量 100.0%）、β-細(xì)辛醚（112018-201601，含有量96.8%）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；α-細(xì)辛醚（2883-98-9，含有量98.0%）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司；去氫土莫酸（6754-16-1，含有量98.0%）、去氫茯苓酸（77012-31-8，含有量98.0%）對照品購自南京森貝伽生物科技有限公司；茯苓酸（29070-92-6，含量98.0%）對照品購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.05% 磷酸（B），梯度洗脫（0～13.0 min，21.0% A；13.0～29.0 min，21.0%～43.0% A；29.0～41.0 min，43.0%～72.0% A；41.0～52.0 min，72.0%～90.0% A；52.0～60.0 min，90.0%～21.0% A）；0～22.0 min 時(shí)在320 nm［2-3］波長下檢測遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽?，22.0～29.0 min 時(shí)在269 nm［4-5］波長下檢測黨參炔苷，29.0～41.0 min時(shí)在257 nm［6］波長下檢測β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚，41.0～60.0 min 時(shí)在210 nm［7］波長下檢測去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取各對照品適量，70%甲醇制成分別含遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ1.538 mg／mL、3，6′-二芥子?；崽?.812 mg／mL、黨參炔苷1.754 mg／mL、β-細(xì)辛醚4.332 mg／mL、α-細(xì)辛醚2.158 mg／mL、去氫土莫酸0.396 mg／mL、去氫茯苓酸0.318 mg／mL、茯苓酸0.482 mg／mL 的貯備液，各精密量取適量，70% 甲醇制備，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為76.9、140.6、87.7、433.2、107.9、19.8、15.9、24.1 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取丸劑適量研細(xì)，精密稱取2.0 g，加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照丸劑處方及工藝，分別制備缺遠(yuǎn)志、黨參、石菖蒲、茯苓的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分與相鄰色譜峰均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3 500，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液各適量，70%甲醇分別制成25倍差的6個(gè)系列質(zhì)量濃度線標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，測得遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽恰Ⅻh參炔苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為0.89%、0.73%、0.77%、0.59%、0.65%、1.14%、1.19%、1.07%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一丸劑（批號170902），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽?、黨參炔苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸含有量RSD 分別為 1.11%、1.06%、1.10%、0.97%、1.02%、1.72%、1.83%、1.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號170902）的，室溫下于0、2、4、6、12、16 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽恰Ⅻh參炔苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為 0.85%、0.78%、0.83%、0.64%、0.71%、1.06%、1.15%、1.03%，表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的丸劑（批號170902）適量，研成細(xì)粉，精密稱取6份，每份約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液（遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ0.849 mg／mL、3，6′-二芥子?；崽?.562 mg／mL、黨參炔苷1.097 mg／mL、β-細(xì)辛醚4.619 mg／mL、α-細(xì)辛醚1.607 mg／mL、去氫土莫酸0.301 mg／mL、去氫茯苓酸0.192 mg／mL、茯苓酸0.368 mg／mL）各1.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽?、黨參炔苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸平均加樣回收率（RSD）分別為98.58%（1.17%）、99.46%（0.97%）、97.98%（1.30%）、100.04%（0.69%）、99.33%（0.59%）、97.66%（1.36%）、96.93%（1.44%）、97.84%（1.20%）。

2.4 相對校正因子計(jì)算 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下線標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以3，6′-二芥子?；崽菫閮?nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7種成分的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，考察Waters 2695、LC-2010高效液相 色譜 儀，以 及Kromasil C18、Shim-pack C18、ODS-C18色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6 色譜峰定位 以3，6′-二芥子酰基蔗糖為內(nèi)標(biāo)，考察其他7種成分在“2.5”項(xiàng)色譜儀、色譜柱下的相對保留值，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響。

表4 各成分相對保留值Tab.4 Relative retention values of various constituents

2.7 樣品含有量測定 取3批丸劑（批號為170902、180201、180403）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算含有量，結(jié)果見表5，可知2種方法所得結(jié)果無明顯差異，相對平均偏差（RAD）＜2%。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 寧神定志丸中遠(yuǎn)志為君藥，主要含有皂苷、糖酯、口山酮，其中遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ為口山酮類代表性成分，3，6′-二芥子?；崽菫樘酋ヮ惔硇猿煞郑哂辛己玫纳窠?jīng)細(xì)胞保護(hù)、抗抑郁等作用；石菖蒲具有醒神益智、開竅豁痰、化濕開胃的功效，主要含有揮發(fā)油、黃酮、生物堿、氨基酸等成分，以β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚等揮發(fā)油為主；茯苓具有寧心、健脾、利水滲濕等功效，去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸等三萜是其主要藥效成分；黨參具有養(yǎng)血生津、健脾益肺的功效，黨參炔苷為其代表性成分。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇上述8種成分作為指標(biāo)成分。

表5 各成分含量測定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

3.2 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇［4-9］、70%甲醇［2-3，10］、50%甲醇，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇為提取溶劑時(shí)各成分的綜合提取率最高；考察了超聲提?。?-10］、回流提取［2-3］，發(fā)現(xiàn)兩者提取效果差異不大，考慮到操作便捷性，故選擇前者；考察了提取時(shí)間30 min［5，7，10］、45 min［6，8］、60 min［4］，發(fā)現(xiàn)提取45、60 min 時(shí)各成分提取率差異不大，但明顯優(yōu)于提取30 min。最終確定，供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲提取45 min。

3.3 流動相優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水［5，11］、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸［6，8］、乙腈-0.1%甲酸［4，12］、乙腈-0.1%磷酸［10］、乙腈-0.05% 磷酸［2-3，7，9，13-14］流動相系統(tǒng)，同時(shí)對其比例進(jìn)行不斷摸索。最終，選擇乙腈-0.05%磷酸作為流動相，按“2.1”項(xiàng)下比例進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 成分含有量分析 寧神定志丸與其陰性樣品中所測成分相對含有量存在一定差異，以β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚更明顯，可能與藥材所含成分在不同產(chǎn)地、采收期存在差異有關(guān)。因此，企業(yè)在生產(chǎn)時(shí)需關(guān)注原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評法同時(shí)測定寧神定志丸中8種成分的含有量，該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可有效降低檢驗(yàn)成本，為完善提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供全新的方法和依據(jù)。