齊 佳， 崔艷君， 王廣策， 唐 娜， 成 敏， 孫恒一， 綦慧敏??， 劉順梅??

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院,山東 濰坊 261053； 2. 中國科學(xué)院海洋研究所,山東 青島 266071)

肝臟疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激具有密切的相關(guān)性。ROS(活性氧)是細(xì)胞正常代謝活動的產(chǎn)物，主要在線粒體中產(chǎn)生。肝臟細(xì)胞內(nèi)含有豐富的線粒體，代謝活動活躍，更易產(chǎn)生ROS。持續(xù)和過量的ROS能引起細(xì)胞損傷，會導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[1]及肝纖維化、肝硬化和終末期肝細(xì)胞癌的發(fā)生。氧化應(yīng)激也會導(dǎo)致其它疾病及癌癥的發(fā)生。

巖藻黃素，英文名為fucoxanthin(FUCO)，是存在于褐藻和硅藻等藻類中的色素成分，具有抗癌[2-3]、減肥和降血糖[4-5]等多種生物活性。已有研究表明，類胡蘿卜素能夠作為外源性抗氧化劑重構(gòu)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，中和過量的ROS，使細(xì)胞和組織免于過量ROS的損傷[6]。作為類胡蘿卜素家族的一員，F(xiàn)UCO已被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗氧化能力。它能清除1, 1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和超氧自由基，對單態(tài)氧具有淬滅活性[7]。FUCO還能減輕H2O2引起的猴腎成纖維細(xì)胞的DNA的損傷，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的存活率[8]。

H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，是ROS的重要成員之一，易穿透細(xì)胞膜，導(dǎo)致DNA損傷和蛋白質(zhì)的破壞，常被用來建立氧化損傷細(xì)胞模型。鑒于肝病發(fā)生與氧化應(yīng)激的密切關(guān)系及FUCO具有較強(qiáng)的抗氧化活性，本文利用H2O2誘導(dǎo)小鼠BNL CL.2肝細(xì)胞建立氧化損傷細(xì)胞模型探討FUCO對細(xì)胞的保護(hù)作用，以期為FUCO藥用活性研究及肝病治療新藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

儀器：多功能酶標(biāo)儀(Molecular devices，SpectraMax M5美國)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，311，美國)；離心機(jī)(Thermo，Labofuge300，美國)；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝，JY92-ⅡN)。

試劑：巖藻黃素(Sigma)；微量還原型谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；MTT檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基(索萊寶)；胎牛血清(四季青)。

1.2 細(xì)胞株

小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL CL.2：上海酶研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

BNL CL.2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 BNL CL.2細(xì)胞氧化損傷模型的建立[9]

以H2O2誘導(dǎo)建立BNL CL.2細(xì)胞氧化損傷模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組和H2O2處理組，H2O2組設(shè)100、200、400、 600、 800、1 000、 1 200和1 600 μmol/L共8個(gè)濃度。每組設(shè)3個(gè)平行孔。

濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液按100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。24 h后，空白對照組換為無血清培養(yǎng)液，H2O2組分別換為含不同濃度H2O2的無血清培養(yǎng)液，各組繼續(xù)放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后， PBS清洗細(xì)胞，按照MTT試劑盒說明書檢測各組的細(xì)胞活力，根據(jù)細(xì)胞活力篩選建立氧化損傷模型的最適H2O2濃度。

2.3 細(xì)胞活力測定

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組(Con)、陽性對照組(VE：維生素E，50 μmol/L VE+ 1 000 μmol/L H2O2)、H2O2模型組(Mod，1 000 μmol/L H2O2)和FUCO組。FUCO組設(shè)1、5、10、20 μmol/L 4個(gè)濃度，分別用 F1(1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2)、F5(5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2)、F10(10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2)和F20(20 μmol/L FUCO+ 1 000 μmol/L H2O2)表示。每組3個(gè)平行孔。

1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，空白對照組和H2O2模型組換為無血清培養(yǎng)液，VE組換為含50 μmol/L VE的無血清培養(yǎng)液，F(xiàn)UCO組換為含不同濃度FUCO的無血清培養(yǎng)液。上述各組在培養(yǎng)2 h后，除空白對照組外，其余組全部加入終濃度為1 000 μmol/L的H2O2置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后用MTT法測量各組細(xì)胞的活力。

2.4 細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量測定

實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)空白對照組(Con)、最大酶活性組(Max)、陽性對照組(VE)、H2O2模型組(Mod)和FUCO組(F1、F5、F10、F20)。VE組、Mod組及F1、F5、F10、F20組藥物濃度同2.3。每組設(shè)3個(gè)平行孔。

濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液按照200 μL/孔 接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。24 h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗一次。Con、Max和Mod組換為無血清培養(yǎng)液，VE組換為含50 μmol/L VE的無血清培養(yǎng)液，F(xiàn)1、F5、F10及F20組換為含相應(yīng)濃度FUCO的無血清培養(yǎng)液。藥物與細(xì)胞預(yù)孵育2 h后，除Con和Max組外，其余組全部加入終濃度為1 000 μmol/L 的H2O2。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，Max組加入10 μL LDH釋放試劑后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 h后，分別取各孔的細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中，400g離心5 min，各取120 μL上清加入96孔培養(yǎng)板中，增設(shè)只加藥物的空白背景孔。各孔分別加入60 μL LDH工作液，混勻后于25 ℃避光烘箱孵育30 min。酶標(biāo)儀490 nm處測定各組吸光度，計(jì)算乳酸脫氫酶釋放率。計(jì)算公式為：LDH釋放率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100%。

2.5 細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量測定

實(shí)驗(yàn)分組及各組細(xì)胞處理方法同2.3。細(xì)胞懸液接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，重復(fù)3次。

細(xì)胞處理結(jié)束后，胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，PBS清洗細(xì)胞，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后取一定量細(xì)胞懸液用BCA法測定蛋白濃度。取勻漿上清液100 μL，加入試劑一100 μL混勻后于3 500 g/min離心10 min，取上清液待測。根據(jù)試劑盒說明書，按照表1進(jìn)行反應(yīng)體系的操作。將反應(yīng)物混勻后，靜置5 min，在酶標(biāo)儀405 nm波長下測量各組吸光度，計(jì)算GSH含量。計(jì)算公式：GSH含量=[(測定孔-空白孔)/(標(biāo)準(zhǔn)孔-空白孔)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 μmol/L)×2÷蛋白濃度。

表1 GSH檢測反應(yīng)體系Table 1 The reaction system for GSH test /μL

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量測定

實(shí)驗(yàn)分組同2.3，每組3個(gè)平行孔。

1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL。24 h后，Con和Mod組換為無血清培養(yǎng)液，VE組及F1、F5、F10和F20組分別換為含相應(yīng)藥物及濃度的無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，除Con外，其余各組均加入終濃度為1 000 μmol/L的H2O2處理30 min。DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)用無血清培養(yǎng)液稀釋使其終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后先去除各孔內(nèi)的培養(yǎng)液，再加入適當(dāng)體積上述DCFH-DA培養(yǎng)液，放于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后用PBS清洗3次，5 min/次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用熒光酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長下測量各孔吸光度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果與討論

3.1 BNL CL.2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

不同濃度H2O2處理BNL CL.2細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞活力見圖1?？瞻讓φ战M細(xì)胞活力設(shè)為100%。與對照組相比，100、200、400、 600、 800、1 000、 1 200、1 600 μmol/L H2O2組細(xì)胞活力分別下降至(88.90±8.54)%、 (85.67±10.90)%、(83.67±12.64)%、(79.75±13.61)%、(75.60±14.90)%、(65.76±18.19)%、(64.67±15.59)%和(58.21±12.81)%。細(xì)胞活力隨著H2O2濃度的增加而下降，且逐漸出現(xiàn)細(xì)胞觸角消失、形態(tài)變圓、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清等現(xiàn)象。

圖1 建立氧化損傷細(xì)胞模型H2O2作用濃度篩選 (n=3 )Fig.1 Screening of H2O2 concentration for the establishment of oxidatively damaged cell model (n=3 )

由于H2O2濃度過大，會導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡甚至死亡，因此，我們選擇細(xì)胞存活率在(65.76±18.19)%之間的1 000 μmol/L H2O2作用24 h來建立氧化損傷模型進(jìn)行后續(xù)研究。該作用濃度與liu等[9]用來誘導(dǎo)BNL CL.2氧化損傷所用的H2O2濃度相同。

3.2 FUCO提高H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的活力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。Con組細(xì)胞活力設(shè)為100%，Mod組的細(xì)胞活力下降至(65.76±18.19)% (vs Con,P< 0.01)。而藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h后經(jīng)H2O2處理24 h，VE組細(xì)胞活力上升至(88.47±10.61)% (vs Mod,P<0.05)。F1、F5及F10組細(xì)胞活力均比Mod組增加，但三者與Mod組相比無明顯差異(P> 0.05)，F(xiàn)20組的細(xì)胞活力明顯高于Mod組(P< 0.05)，為(91.54±10.45)%。

(*: 與空白對照組相比, P<0.05；#: 與模型組相比, P<0.01. *: P<0.05, vs Con；#: P<0.01, vs Mod. Con: 空白對照組Control group；Mod：1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2 Modle group;F1：1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F5：5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2； F10：10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F20：20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2; VE: 50 μmol/L VE+ 1 000 μmol/L H2O2。)

H2O2可誘發(fā)細(xì)胞損傷和凋亡，可使細(xì)胞活力下降。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，1～20 μmol/L的FUCO與細(xì)胞預(yù)孵育2 h可減輕H2O2對細(xì)胞造成的氧化損傷，F(xiàn)UCO組的細(xì)胞活力均高于H2O2處理組。這與Heo等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Heo等用H2O2處理猴腎成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5～200 μmol/L的FUCO均可顯著提高H2O2損傷細(xì)胞的活力。

3.3 FUCO降低H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放量

將最大酶活性組LDH釋放率設(shè)為100%，各組細(xì)胞的LDH釋放率見圖3。Con組LDH釋放率為(25.94±5.01)%，Mod組增至(66.66±5.19)%，比Con組明顯提高(P< 0.05)。但藥物與細(xì)胞預(yù)孵育2 h后再經(jīng)H2O2處理，VE組和4個(gè)FUCO組的LDH釋放率均比Mod組明顯降低(P< 0.05)，其中5 μmol/L FUCO組釋放率最低，為(28.48±5.86)%, 對細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于50 μmol/L 的VE(35.27%±4.96%)。

LDH是活細(xì)胞漿內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞損傷、細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變時(shí)，胞內(nèi)的LDH會透過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，LDH檢測可作為評價(jià)細(xì)胞膜破壞程度的重要指標(biāo)[10]。過量ROS可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子的破壞，細(xì)胞內(nèi)的LDH就會釋放出來。本研究發(fā)現(xiàn)1～20 μmol/L的FUCO能顯著降低模型細(xì)胞LDH的釋放水平(P<0.05)，表明FUCO可以抵御H2O2對細(xì)胞膜的破環(huán)作用，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，減輕H2O2引起的細(xì)胞毒性。

(*: 與空白對照組相比, P<0.05；#: 與模型組相比, P<0.01. *: P<0.05, vs Con；#: P<0.01, vs Mod. Con: 空白對照組Control group；Mod：1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2Modle group; F1：1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F5：5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F10：10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F20：20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2; VE:50 μmol/L VE+1 000 μmol/L H2O2。)

3.4 FUCO提高H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的還原型谷胱甘肽含量

圖4所示為各組細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量。Con組細(xì)胞的GSH設(shè)為100%。從圖中可以看出，與Con組相比， Mod組細(xì)胞內(nèi)的GSH含量明顯降低(P<0.05)，下降至(72.55±5.00)%。VE和1～20 μmol/L的FUCO均可使細(xì)胞內(nèi)的GSH含量顯著增加(P< 0.01)，且FUCO的作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，20 μmol/L組GSH含量最高。

GSH是機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化劑之一。H2O2刺激細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的GSH可被H2O2氧化生成 氧化型谷胱甘肽GSSG，從而減少了脂質(zhì)過氧化物的形成，可使細(xì)胞和機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1～20 μmol/L的FUCO可使H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著增加。Ha等[11]的小鼠實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)FUCO能通過誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的高表達(dá)減輕高脂飼料引起的氧化應(yīng)激。上述結(jié)果表明FUCO有可能通過促進(jìn)細(xì)胞和機(jī)體的抗氧化酶表達(dá)發(fā)揮其抗氧化作用。

(*: 與空白對照組相比, P<0.05；#: 與模型組相比, P<0.01. *: P<0.05, vs Con；#: P<0.01, vs Mod. Con: 空白對照組Control group；Mod：1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2 Modle group;F1：1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F5：5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F10：10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F20：20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2; VE:50 μmol/L VE+ 1 000 μmol/L H2O2。)

3.5 FUCO降低H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的活性氧

DCFH-DA是檢測細(xì)胞內(nèi)ROS常用的探針，是一種非熒光性化合物，在細(xì)胞內(nèi)可被ROS催化產(chǎn)生能發(fā)熒光的DCF，從而可反映細(xì)胞內(nèi) ROS 的含量[12]。本實(shí)驗(yàn)用此方法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的結(jié)果如圖5所示。Con組細(xì)胞內(nèi)ROS為84.95±8.78，Mod組的ROS與對照組相比明顯增高(P< 0.05)，為130.44 ±4.22。藥物與細(xì)胞預(yù)孵育24 h再經(jīng)H2O2處理30 min，50 μmol/L VE與1、5及10 μmol/L的FUCO 均可顯著抑制H2O2引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)ROS升高(vs Mod,P< 0.05)，20 μmol/L的FUCO雖然沒能明顯降低ROS含量(P> 0.05)，但也表現(xiàn)出了良好的清除ROS活性，20 μmol/L FUCO組細(xì)胞的ROS含量低于H2O2模型組。

LDH檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)1～20 μmol/L FUCO可顯著降低細(xì)胞LDH的釋放，但20 μmol/L FUCO對LDH的抑制作用較1、5及10 μmol/L FUCO稍弱。這個(gè)結(jié)果可能與20 μmol/L FUCO對ROS的清除能力低于1～10 μmol/L FUCO有關(guān)。20 μmol/L FUCO對ROS的清除能力差，細(xì)胞內(nèi)存在的ROS就多，對細(xì)胞膜的破壞能力強(qiáng)，因此細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放就會增多。

盡管20 μmol/L FUCO對ROS的清除能力較差，但20 μmol/L FUCO組細(xì)胞內(nèi)的GSH含量卻較1、5、10 μmol/L FUCO組要高。細(xì)胞內(nèi)的高GSH含量可能與20 μmol/L FUCO組細(xì)胞的活力最高有一定關(guān)系。

綜合考慮上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)UCO有可能通過多種復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免于H2O2造成的氧化損傷，而不是通過單一或簡單的方式應(yīng)對氧化應(yīng)激，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究和探討。

(*: 與空白對照組相比, P<0.05；#: 與模型組相比, P<0.05。*: P<0.05, vs Con；#: P<0.05, vs Mod. Con: 空白對照組Control group；Mod：1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2 Modle group；F1：1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F5：5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F10：10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；F20：20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2；VE:50 μmol/L VE+1 000 μmol/L H2O2。)

4 結(jié)語

本研究發(fā)現(xiàn)1～20 μmol/L 的FUCO能夠清除H2O2誘發(fā)的胞內(nèi)ROS，提高細(xì)胞GSH含量，降低細(xì)胞LDH釋放率，提高細(xì)胞活力，具有良好的抗氧化作用。

抗氧化劑發(fā)揮抗氧化的作用主要通過2種方式：一是通過直接清除活性氧類物質(zhì)發(fā)揮作用，二是通過誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)間接發(fā)揮作用。綜合考慮本文及他人的研究結(jié)果，推測FUCO主要是通過直接清除ROS和誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)2種方式，通過多條調(diào)控路徑來實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用。