王佳佳， 李 健， 葛倩倩， 高海鈺， 李吉濤， 趙法箴,

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島266003； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237； 3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071)

生長性狀是水產(chǎn)動物育種研究過程中重要的衡量指標(biāo)，也是直接的育種目標(biāo)。周期性蛻皮跳躍式生長是甲殼動物特殊的生長發(fā)育方式，甲殼動物的一生中要進(jìn)行多次脫殼才能完成其全部的生長發(fā)育，所以，甲殼動物的生長發(fā)育主要依賴于蛻皮過程中肌肉的重塑和生長速率[1-3]。脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國重要的小型經(jīng)濟(jì)蝦類，以黃、渤海產(chǎn)量最高，具有生長速度快、繁殖周期短(一年可繁殖2～3代)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點[4]，因而研究脊尾白蝦的生長發(fā)育的調(diào)控，不僅具有理論價值，還具有重要的實際意義。

甲殼動物的肌肉結(jié)構(gòu)與哺乳動物等其他脊椎動物一樣，肌纖維是由肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白等構(gòu)成的肌節(jié)單元組成[5]。其中，肌球蛋白是一類高度保守且廣泛存在于真核細(xì)胞中的多功能蛋白，是構(gòu)成骨骼肌和心肌的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白之一。在脊椎動物和無脊椎動物肌肉中的肌球蛋白基本結(jié)構(gòu)是一致的，一個完整的常規(guī)肌球蛋白(也稱為Ⅱ型肌球蛋白)分子是由2條肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain, MHC)、2條必需輕鏈(Myosin light chain, MLC)和2條的調(diào)節(jié)性輕鏈組成的六聚體[6-7]。肌球蛋白重鏈具有ATP酶活性，且能夠與肌動蛋白結(jié)合，這兩個特性使其在肌球蛋白分子間的相互作用和肌肉的收縮中起主導(dǎo)作用；肌球蛋白輕鏈?zhǔn)钦{(diào)控鏈，而且其對肌球蛋白重鏈有某種調(diào)控作用[8]。肌球蛋白既是肌肉細(xì)胞的重要組成成分，同時在肌肉運動、肌細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運、胞質(zhì)流動、能量供應(yīng)和信號傳導(dǎo)等生理活動中發(fā)揮重要的作用[9]。

有關(guān)肌球蛋白的研究主要涉及到功能特性、理化性質(zhì)、肌肉類型和生物學(xué)效應(yīng)等諸多領(lǐng)域[10]。相對于脊椎動物MHC和MLC基因的研究[11-13]，甲殼動物的研究相對較少，李文蘭等[14]通過抑制消減雜交的方法獲得凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的MLC基因，發(fā)現(xiàn)MLC的表達(dá)量在生長速度較快的時期顯著高于其它時期；Koyama等[15]克隆凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)的2種MHC的亞型，并分析其在整個生長發(fā)育過程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦的MHCa基因在仔蝦期開始表達(dá)，而斑節(jié)對蝦的MHCa基因只在成蝦中表達(dá)。

在脊椎動物中，利用海量的基因組、轉(zhuǎn)錄組序列信息來挖掘、鑒定與生長發(fā)育的相關(guān)的基因及其分子機(jī)制的研究已經(jīng)取得了長足進(jìn)展，并成為基因組學(xué)、分子遺傳學(xué)的重要發(fā)展方向。然而，由于目前缺乏甲殼動物基因組信息，有關(guān)十足目甲殼動物生長相關(guān)基因的研究還很薄弱，多集中于與蛻皮相關(guān)基因的研究[16]。本研究通過克隆獲得脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1全長序列，并分析其在脊尾白蝦不同組織、不同幼體發(fā)育時期和不同生長時期的大小差異個體組的表達(dá)模式，以期闡明EcMHC2、EcMLC1在脊尾白蝦生長發(fā)育過程中的作用，為完善脊尾白蝦生長發(fā)育調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)資料，也為進(jìn)一步研究該類基因在脊尾白蝦生長和發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品采集

實驗用脊尾白蝦取自日照，體長(44.15±3.02)mm，體重(1.36±0.42)g，暫養(yǎng)一周。養(yǎng)殖水溫(25±1)℃，鹽度31，pH=8.2，持續(xù)充氧，每天換水清污一次，換水量為1/3，投喂配合飼料。取10尾健康的脊尾白蝦各組織，包括肌肉、眼柄、甲殼(不帶表皮)、胃、心臟、腸道、血細(xì)胞、卵巢、鰓和肝胰臟于液氮中研磨，用于RNA的提取。

梁象秋等[17]對脊尾白蝦幼體發(fā)育特征進(jìn)行描述，其中溞狀幼體Ⅱ期時，其頭胸甲出現(xiàn)眼上刺和頰刺，眼柄延長，并與頭胸甲分離，可以轉(zhuǎn)動。在溞狀幼體時期，脊尾白蝦在水中倒向運動，轉(zhuǎn)為仔蝦后開始腹部向下的向前運動。本實驗選取溞狀幼體Ⅰ期至Ⅵ期的脊尾白蝦，轉(zhuǎn)為仔蝦時期第1天、第5天和第10天的脊尾白蝦各6尾，置于液氮中研磨，用于RNA的提取。脊尾白蝦孵化為溞狀幼體的第1天記為1日齡，在仔蝦60、80、100和120日齡分別選擇極大個體和極小個體各10尾，測量其體長體重后(見表1)，分為極大個體組(H組)和極小個體組(L組)，分組取腹部肌肉組織混合后置于液氮中研磨，用于RNA的提取。

表1 脊尾白蝦大小差異個體組生長性狀比較

Note：①Growth stages；②Groups；③Body weight；④Body length；⑤60 days old；⑥80 days old；⑦100 days old；⑧120 days old

1.2 EcMHC2、EcMLC1的cDNA全長克隆

通過Trizol法提取脊尾白蝦各組織的總RNA，利用紫外分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳等方式對提取的總RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。選擇質(zhì)量及完整性較好的肌肉組織的總RNA，使用SMARTTMRACEcDNA Amplification Kit分別合成3’和5’RACE的cDNA第一鏈。從脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得EcMHC2、EcMLC1基因部分EST序列，利用PrimerPremier 6.0軟件設(shè)計中間片段引物驗證其準(zhǔn)確性后，設(shè)計3’和5’RACE特異性引物(見表2)。3’和5’RACE引物分別與UPM配對進(jìn)行cDNA的3’和5’末端擴(kuò)增。參照核酸凝膠回收試劑盒說明書，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后通過切膠回收得到擴(kuò)增目的片段，將目的片段與pEASY-T1載體連接，然后轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞TransT1中，過夜培養(yǎng)后，通過藍(lán)白斑篩選挑出陽性單克隆，經(jīng)PCR檢測合格后送測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用DNAStar軟件SeqMan程序進(jìn)行拼接序列的拼接與組裝，得到2個基因的cDNA全長。NCBI ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定其開放閱讀框并預(yù)測氨基酸序列，利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對。用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)對推測蛋白進(jìn)行基本理化參數(shù)分析；根據(jù)PredictProtein工具(https://www.predictprotein.org/)分析蛋白二級結(jié)構(gòu)及功能；InterProScan工具(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析結(jié)構(gòu)域。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstraps設(shè)為1 000次)。

表2 本研究所用引物序列

1.4 反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

將脊尾白蝦肌肉、眼柄、甲殼、胃、心臟、腸道、血細(xì)胞、卵巢、鰓和肝胰臟等組織及不同幼體發(fā)育時期、不同生長階段的大個體組和小個體組的肌肉組織提取總RNA，按照TakaraPrime ScriptTMRTreagentKit說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

Duan等[18]研究發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦18SrRNA作為內(nèi)參基因具有穩(wěn)定性，本研究根據(jù)脊尾白蝦18SrRNA(登錄號：GQ369794)序列設(shè)計熒光定量引物并利用geNorm程序，并對18SrRNA內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算出基因表達(dá)穩(wěn)定性的平均值M，通常M<1.5為選擇閾值，認(rèn)為內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性較好。本實驗中結(jié)果顯示不同組織間的M值為0.435，不同幼體生長發(fā)育階段的M值為0.600，大小差異個體不同生長階段的M值為0.479，表明選擇脊尾白蝦18SrRNA作為內(nèi)參基因具有較高的穩(wěn)定性。

根據(jù)脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1和內(nèi)參基因18SrRNA的開放閱讀框cDNA序列，由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成熒光定量引物(見表2)。參照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ說明書，利用ABI 7500 Real Time PCR儀器進(jìn)行熒光定量分析。10 μL反應(yīng)體系包括: 5 μL SYBR Premix Ex TaqTMII (2×)、0.2 μL ROX Reference Dye II (50×)、0.4 μL 10 μmol/L的正反向引物、3.0 μL去離子水、1.0 μL cDNA。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，收集熒光信號，共40個循環(huán)；溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，每個循環(huán)增加0.5 ℃，收集熒光信號。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算18SrRNA、EcMHC2、EcMLC1的熒光定量引物擴(kuò)增效率，根據(jù)公式E=10(-1/S)-1(S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，計算可得其擴(kuò)增效率分別為103.2%、101.3%和102.7%。每個實驗組設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)分析，數(shù)據(jù)處理使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性等統(tǒng)計學(xué)分析，利用Origin Pro 9.0對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行作圖，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 EcMHC2、EcMLC1的cDNA全長序列的獲得及氨基酸序列分析

3’RACE和5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物分別測序后與中間片段進(jìn)行拼接，獲得脊尾白蝦肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈基因的全長cDNA序列，分別命名為EcMHC2、EcMLC1，GenBank登錄號為MG545144、MG545145。EcMHC2全長5 929 bp，包括127 bp的5’端非編碼區(qū)(UTR)，72 bp的3’端非編碼區(qū)和5 727 bp的開放閱讀框，編碼1909個氨基酸，預(yù)測分子量大小為216.97 kD，理論等電點為5.62。EcMLC1全長1 506 bp，包括69bp的5’端非編碼區(qū)(UTR)，975bp的3’端非編碼區(qū)和459 bp的開放閱讀框，編碼153個氨基酸，預(yù)測分子量大小為17.39 kD，理論等電點為4.64。3’端含有多聚腺苷酸加尾信號AATAAA和PolyA。

采用InterProScan分析蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，與其它肌球蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)相似，EcMHC2可分為頭區(qū)(81-778 aa)和尾區(qū)(844-1906 aa)，N端有一種選擇性結(jié)合多脯氨酸配體的結(jié)構(gòu)域Src同源區(qū)3(Src homology 3, SH3)(37-71 aa)(見圖1)。編碼的EcMLC1氨基酸序列經(jīng)InterProScan分析發(fā)現(xiàn)，在8-43aa處和82-117aa處各有1個可與Ca2+結(jié)合的EF-hand結(jié)構(gòu)(見圖2)。Predict Protein分析發(fā)現(xiàn)EcMLC1具有46.41%的LOOP環(huán)和53.59%螺旋結(jié)構(gòu)。

(ATG起始密碼子；TAA終止密碼子；AATAAA多腺苷酸信號；“*”表示終止密碼子；劃線部分是結(jié)構(gòu)域Src同源區(qū)3；第一個實線框是頭區(qū)，第二個實線框是尾區(qū)。ATG is a start codon; TAA is a stop codon; AATAAA is a consensus polyadenylation signal; ‘*’represents no translation amino acid.SH3 is underlined; Head region and tail region are boxed in the first and second region, respectively.)

(ATG起始密碼子；TAA終止密碼子；AATAAA多腺苷酸信號；“*”終止密碼子；劃線區(qū)是EF-hand結(jié)構(gòu)。ATG is a start codon; TAA is a stop codon; AATAAA is a consensus polyadenylation signal; ‘*’represents no translation amino acid. EF-hand domain is underlined. )

2.2 EcMHC2、EcMLC1同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

通過BLAST同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦EcMHC2氨基酸序列與斑節(jié)對蝦MHC2(GenBank登錄號：BAM65720.1)的同源性最高為87%，因此本實驗克隆所得肌球蛋白重鏈基因為Ⅱ型肌球蛋白重鏈的MHC2亞型；EcMLC1氨基酸序列與大西洋溝蝦(Palaemonvarians)MLC1(GenBank登錄號：ACR 54116.1)的同源性最高為96%，與克氏原鰲蝦MLC1(GenBank登錄號：ACR54116.1)的同源性為94%，因此，本實驗克隆所得為Ⅱ型肌球蛋白堿性輕鏈的MLC1亞型。

利用MEGA 6.0軟件對MHC、MLC進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明顯示肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈在進(jìn)化上聚類為兩大支脊索動物和無脊椎動物。脊尾白蝦EcMHC2與斑節(jié)對蝦等十足目甲殼動物聚為一支，EcMLC1與大西洋溝蝦等聚為一枝，然后與昆蟲分支聚為一大枝；脊索動物中被囊動物、鳥類、魚類和哺乳動物聚為一支(見圖3)。

圖3 脊尾白蝦EcMHC2(A)、EcMLC1(B)氨基酸序列NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1的組織表達(dá)特征

利用熒光定量的方法檢測EcMHC2、EcMLC1在脊尾白蝦各個組織中的表達(dá)情況(見圖4)。結(jié)果顯示，EcMHC2、EcMHC2的組織表達(dá)量情況比較相似：在肌肉組織中的表達(dá)量最高，眼柄次之，而在其他組織中表達(dá)量均比較低(P<0.05)。

2.4 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1在受精卵和幼體發(fā)育時期的表達(dá)特征

如圖5所示，對比幼體發(fā)育各時期，受精卵時期脊尾白蝦體內(nèi)的EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量較低(P<0.05)。隨著幼體的發(fā)育，脊尾白蝦體內(nèi)的EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，在仔蝦第1天達(dá)到最大(P<0.05)，然后表達(dá)量顯著下降。在脊尾白蝦溞狀幼體II期EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量顯著高于溞狀幼體發(fā)育的其它各時期(P<0.05)；在溞狀幼體Ⅵ期、Ⅴ期，EcMHC2的表達(dá)量無顯著性差異，但顯著高于Ⅲ期、Ⅳ期(P<0.05)。EcMLC1的表達(dá)量在蚤狀發(fā)育的5個時期(I、Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ和Ⅳ期)無顯著性差異。

2.5 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1在大小差異個體中的表達(dá)特征

在脊尾白蝦不同生長階段，分別測定極大個體組(H組)和極小個體組(L組)的體長、體重(見表1)。在脊尾白蝦生長的四個階段中，EcMHC2在H組的表達(dá)量均顯著的高于L組；在60、80和120日齡時，H組的表達(dá)量均顯著的高于L組；100日齡時，EcMLC1表達(dá)量在H組與L組無顯著性差異。在H組和L組中，80日齡時EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量最高。

(不同小寫字母表示EcMHC2和EcMLC1在不同組織的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of EcMHC2,EcMLC1 mRNA expressions in different tissues (P<0.05).)

(Oo. 受精卵時期；Z1.溞狀幼體Ⅰ期；Z2.溞狀幼體Ⅱ期；Z3.溞狀幼體Ⅲ期；Z4.溞狀幼體Ⅳ期；Z5.溞狀幼體Ⅴ期；Z6.溞狀幼體Ⅵ期；P1.仔蝦第1天；P5.仔蝦第5天；P10.仔蝦第10天。不同小寫字母表示EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量在受精卵和幼體不同發(fā)育時期差異顯著(P<0.05).Oo. Oosperm, Z1.zoeaⅠ, Z2. zoeaⅡ, Z3.zoeaⅢ, Z4.zoeaⅣ, Z5.zoeaⅤ, Z6.zoeaⅥ, P1.postlarva-1, P5.postlarva-5, P10.postlarva-10. Different lowercase letters indicate significant difference of EcMHC2 and EcMLC1 mRNA expressions during oosperm and different early larval development stages (P<0.05).)

(不同小寫字母表示EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量在不同組別不同生長階段差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of EcMHC2 and EcMLC1 mRNA expressions during different group and stages (P<0.05).)

3 討論

3.1 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1氨基酸序列分析

本研究克隆獲得脊尾白蝦EcMHC2，具有Ⅱ型肌球蛋白家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)：由頭部區(qū)域和尾部區(qū)域組成，具有SH3結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合位點等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[19]。肌球蛋白重鏈的N-末端的頭部區(qū)域保守性較強(qiáng)是肌球蛋白家族的主要功能域，是肌球蛋白“分子馬達(dá)”功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)，具有ATP酶活性位點及與肌動蛋白的結(jié)合位點，在肌肉收縮過程中，肌球蛋白重鏈和輕鏈相互纏繞形成肌球蛋白，通過使分子間構(gòu)型變化使肌球蛋白與ATP結(jié)合，引起頭部與肌動蛋白結(jié)合減弱而使ATP水解產(chǎn)生能量，供頭部遷移、滑動[20]。對不同的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)尾部結(jié)構(gòu)域差異較大，末端尾部呈卷曲螺旋形態(tài)，其主要在調(diào)節(jié)運動活動中起作用。

細(xì)胞中最廣泛的存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，一般是由具有EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白參與執(zhí)行的[21]。EF-hand是一種由螺旋區(qū)-環(huán)-螺旋(Helix-loop-helix motif，HLH)構(gòu)型構(gòu)成的Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)，通常成對出現(xiàn)。每個EF-hand結(jié)構(gòu)域是由12個殘基組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及兩側(cè)各12個堿基組成的α螺旋組成，而位于中央的環(huán)區(qū)是肌球蛋白輕鏈與Ca2+的結(jié)合區(qū)域。分析EcMLC1氨基酸結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與Ca2+結(jié)合的2個EF-hand結(jié)構(gòu)。對比其它4種甲殼動物，包括大西洋溝蝦、褐蝦(Crangoncrangon)、克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)和日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)的MLC氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，都存在2個EF-hand結(jié)構(gòu)。EF-hands的結(jié)構(gòu)是由一個鈣離子結(jié)合域經(jīng)過4次串聯(lián)重復(fù)的方式進(jìn)化而來。在高等脊椎動物中，肌球蛋白輕鏈和肌鈣蛋白C由同一個祖先進(jìn)化而來，均含有4個相似的能與Ca2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[22]，而無脊椎動物的肌球蛋白輕鏈EF-hand結(jié)構(gòu)，由于在進(jìn)化過程中Ca2+結(jié)合所必需的氨基酸殘基發(fā)生突變，導(dǎo)致蛋白中某些EF-hand結(jié)構(gòu)失去了與Ca2+結(jié)合的能力[23-24]。

肌球蛋白是多基因家族具有不同的亞型，在哺乳動物中，已發(fā)現(xiàn)的肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈分別有10余種亞型。甲殼動物中，MHC1和MHC2在多種蝦類中發(fā)現(xiàn)，且可能與幼體的發(fā)育有關(guān)[15]；MLC1和MLC3在堿性條件下容易從肌球蛋白分子上解離下來，故稱堿性輕鏈[25]，其參與肌球蛋白與肌動蛋白相互作用，而且MLC1和MLC3表達(dá)量的比值與肌肉收縮速率存在線性關(guān)系[26]。

3.2 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1表達(dá)分析

脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1具有組織表達(dá)的特異性，通過熒光定量PCR分析可以看出EcMHC2、EcMLC1主要在肌肉中表達(dá)，其次是眼柄、甲殼，而在其它組織的表達(dá)量較低。在其它的動物中MHC、MLC的表達(dá)模式也不盡相同，翹嘴鱖(Sinipercachuasti)MHC主要在紅肌中表達(dá)量最高，在其余組織中表現(xiàn)為中低表達(dá)[27]；凡納濱對蝦的MLC主要在肌肉中表達(dá)，其次是心臟和鰓組織，而在其它組織中的表達(dá)量較低[14]；桔小實蠅(Bactroceradorsalis)MLC在胸部的肌肉表達(dá)量顯著的高于其它組織[28]。MHC、MLC在不同的物種中主要的表達(dá)組織器官為肌肉組織的主要原因是肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈?zhǔn)羌⌒」?jié)粗肌絲的組成成分，促進(jìn)肌肉生長的重要基因，而次要的表達(dá)部位有所不同，可能的原因是是肌球蛋白的不同亞型的表達(dá)模式不同。

在無脊椎動物中，對于調(diào)控肌球蛋白基因表達(dá)的機(jī)制研究很少，而在哺乳動物和魚類中的大量研究表明其主要受體內(nèi)的一些重要的信號通路調(diào)節(jié)。研究表明鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路(CaN-NFAT)是一種受細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)的信號通路，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，NFAT進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其他的輔助因子結(jié)合后作用到特異的靶基因，從而促使肌球蛋白基因的表達(dá)[29]；MRF基因家族在調(diào)控肌球蛋白基因表達(dá)上起關(guān)鍵作用，在肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，MyoD起著總開關(guān)的作用，特殊的結(jié)構(gòu)域與肌球蛋白等基因的啟動子區(qū)結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄激活[30]；Myogenin作為一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它的表達(dá)啟動了一系列收縮蛋白如肌球蛋白重鏈的表達(dá)[31]；研究表明不同肌球蛋白重鏈基因之間存在的拮抗和促進(jìn)作用，MHC7b可以通過促進(jìn)miR-499的表達(dá)從而抑制MHC7的表達(dá)[32]，總之，肌球蛋白基因的表達(dá)受多種因子調(diào)控。

脊尾白蝦幼體的發(fā)育過程主要分為6個階段，在溞狀幼體Ⅱ期脊尾白蝦的特點是眼柄出現(xiàn)，并與頭胸甲分離，可以自由的轉(zhuǎn)動[17]。在脊尾白蝦溞狀幼體II期EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量顯著高于溞狀幼體發(fā)育的其它各時期，而在組織表達(dá)分析中EcMHC2、EcMLC1在眼柄中的表達(dá)量也較高，推測EcMHC2、EcMLC1參與了脊尾白蝦眼柄發(fā)生過程。在轉(zhuǎn)為仔蝦的第一天，EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量顯著的高于幼體發(fā)育時期，這是由于仔蝦的形態(tài)習(xí)性與成蝦相似，同溞狀幼體的形態(tài)有很大的變化。變?yōu)樽形r后，脊尾白蝦開始作水平游泳，游泳能力大大增強(qiáng)[33]，此時EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量的升高可能是由于其為肌肉生長提供動力。同時有研究發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對蝦幼體發(fā)育過程中，仔蝦MHC2表達(dá)量顯著高于幼體發(fā)育的其它時期[15]；在脊椎動物胚胎發(fā)育過程中，MHC2表達(dá)量與肌纖維形成的過程具有一致性[34]；在鱖魚幼體發(fā)育過程中，MLC1表達(dá)呈現(xiàn)上升的趨勢[35]，暗示MHC2、MLC1可能在肌肉發(fā)育過程中起作用。

Hevroy等[36]發(fā)現(xiàn)大西洋鮭(Atlanticsalmon)的特定生長率的高低與MHC的表達(dá)量有關(guān)；陳之航等[37]研究發(fā)現(xiàn)在翹嘴鱖早期生長階段中，MHC在快長組中的表達(dá)量大于慢長組；Ren等[38]利用蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)挖掘與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)生長相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)MHC、MLC在大個體組中表達(dá)上調(diào)；李文蘭等[14]發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦MLC的表達(dá)量在高速生長時期時顯著高于其它生長時期。本實驗中，在脊尾白蝦孵化后60、80、100和120日齡，發(fā)現(xiàn)EcMHC2在極大個體組的表達(dá)量均顯著的高于極小個體組。在脊尾白蝦的4個生長階段中，2個組的EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量最高均在80日齡的脊尾白蝦。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了EcMHC2、EcMLC1表達(dá)水平的變化與物種的生長進(jìn)程以及生長速度有極大的相關(guān)性，為肌肉的生長提供分子基礎(chǔ)，但MHC、MLC在生長發(fā)育過程中的作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)語

本研究克隆了脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1基因cDNA的全長序列，并分析其在不同組織、不同幼體發(fā)育時期的表達(dá)情況，以及大小差異個體在不同生長階段的表達(dá)變化。研究結(jié)果表明EcMHC2、EcMLC1在脊尾白蝦肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，然而其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本研究為脊尾白蝦肌球蛋白功能的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，同時為脊尾白蝦生長相關(guān)基因的挖掘提供重要參考依據(jù)。