王佳佳， 李 健， 葛倩倩， 高海鈺， 李吉濤， 趙法箴,

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島266003； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237； 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

生長(zhǎng)性狀是水產(chǎn)動(dòng)物育種研究過(guò)程中重要的衡量指標(biāo)，也是直接的育種目標(biāo)。周期性蛻皮跳躍式生長(zhǎng)是甲殼動(dòng)物特殊的生長(zhǎng)發(fā)育方式，甲殼動(dòng)物的一生中要進(jìn)行多次脫殼才能完成其全部的生長(zhǎng)發(fā)育，所以，甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育主要依賴(lài)于蛻皮過(guò)程中肌肉的重塑和生長(zhǎng)速率[1-3]。脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國(guó)重要的小型經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)，以黃、渤海產(chǎn)量最高，具有生長(zhǎng)速度快、繁殖周期短(一年可繁殖2～3代)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)[4]，因而研究脊尾白蝦的生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，不僅具有理論價(jià)值，還具有重要的實(shí)際意義。

甲殼動(dòng)物的肌肉結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物等其他脊椎動(dòng)物一樣，肌纖維是由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白等構(gòu)成的肌節(jié)單元組成[5]。其中，肌球蛋白是一類(lèi)高度保守且廣泛存在于真核細(xì)胞中的多功能蛋白，是構(gòu)成骨骼肌和心肌的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白之一。在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物肌肉中的肌球蛋白基本結(jié)構(gòu)是一致的，一個(gè)完整的常規(guī)肌球蛋白(也稱(chēng)為Ⅱ型肌球蛋白)分子是由2條肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain, MHC)、2條必需輕鏈(Myosin light chain, MLC)和2條的調(diào)節(jié)性輕鏈組成的六聚體[6-7]。肌球蛋白重鏈具有ATP酶活性，且能夠與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，這兩個(gè)特性使其在肌球蛋白分子間的相互作用和肌肉的收縮中起主導(dǎo)作用；肌球蛋白輕鏈?zhǔn)钦{(diào)控鏈，而且其對(duì)肌球蛋白重鏈有某種調(diào)控作用[8]。肌球蛋白既是肌肉細(xì)胞的重要組成成分，同時(shí)在肌肉運(yùn)動(dòng)、肌細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、胞質(zhì)流動(dòng)、能量供應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用[9]。

有關(guān)肌球蛋白的研究主要涉及到功能特性、理化性質(zhì)、肌肉類(lèi)型和生物學(xué)效應(yīng)等諸多領(lǐng)域[10]。相對(duì)于脊椎動(dòng)物MHC和MLC基因的研究[11-13]，甲殼動(dòng)物的研究相對(duì)較少，李文蘭等[14]通過(guò)抑制消減雜交的方法獲得凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的MLC基因，發(fā)現(xiàn)MLC的表達(dá)量在生長(zhǎng)速度較快的時(shí)期顯著高于其它時(shí)期；Koyama等[15]克隆凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的2種MHC的亞型，并分析其在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦的MHCa基因在仔蝦期開(kāi)始表達(dá)，而斑節(jié)對(duì)蝦的MHCa基因只在成蝦中表達(dá)。

在脊椎動(dòng)物中，利用海量的基因組、轉(zhuǎn)錄組序列信息來(lái)挖掘、鑒定與生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)的基因及其分子機(jī)制的研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，并成為基因組學(xué)、分子遺傳學(xué)的重要發(fā)展方向。然而，由于目前缺乏甲殼動(dòng)物基因組信息，有關(guān)十足目甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)相關(guān)基因的研究還很薄弱，多集中于與蛻皮相關(guān)基因的研究[16]。本研究通過(guò)克隆獲得脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1全長(zhǎng)序列，并分析其在脊尾白蝦不同組織、不同幼體發(fā)育時(shí)期和不同生長(zhǎng)時(shí)期的大小差異個(gè)體組的表達(dá)模式，以期闡明EcMHC2、EcMLC1在脊尾白蝦生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用，為完善脊尾白蝦生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)資料，也為進(jìn)一步研究該類(lèi)基因在脊尾白蝦生長(zhǎng)和發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品采集

實(shí)驗(yàn)用脊尾白蝦取自日照，體長(zhǎng)(44.15±3.02)mm，體重(1.36±0.42)g，暫養(yǎng)一周。養(yǎng)殖水溫(25±1)℃，鹽度31，pH=8.2，持續(xù)充氧，每天換水清污一次，換水量為1/3，投喂配合飼料。取10尾健康的脊尾白蝦各組織，包括肌肉、眼柄、甲殼(不帶表皮)、胃、心臟、腸道、血細(xì)胞、卵巢、鰓和肝胰臟于液氮中研磨，用于RNA的提取。

梁象秋等[17]對(duì)脊尾白蝦幼體發(fā)育特征進(jìn)行描述，其中溞狀幼體Ⅱ期時(shí)，其頭胸甲出現(xiàn)眼上刺和頰刺，眼柄延長(zhǎng)，并與頭胸甲分離，可以轉(zhuǎn)動(dòng)。在溞狀幼體時(shí)期，脊尾白蝦在水中倒向運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)為仔蝦后開(kāi)始腹部向下的向前運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)選取溞狀幼體Ⅰ期至Ⅵ期的脊尾白蝦，轉(zhuǎn)為仔蝦時(shí)期第1天、第5天和第10天的脊尾白蝦各6尾，置于液氮中研磨，用于RNA的提取。脊尾白蝦孵化為溞狀幼體的第1天記為1日齡，在仔蝦60、80、100和120日齡分別選擇極大個(gè)體和極小個(gè)體各10尾，測(cè)量其體長(zhǎng)體重后(見(jiàn)表1)，分為極大個(gè)體組(H組)和極小個(gè)體組(L組)，分組取腹部肌肉組織混合后置于液氮中研磨，用于RNA的提取。

表1 脊尾白蝦大小差異個(gè)體組生長(zhǎng)性狀比較

Note：①Growth stages；②Groups；③Body weight；④Body length；⑤60 days old；⑥80 days old；⑦100 days old；⑧120 days old

1.2 EcMHC2、EcMLC1的cDNA全長(zhǎng)克隆

通過(guò)Trizol法提取脊尾白蝦各組織的總RNA，利用紫外分光光度計(jì)與瓊脂糖凝膠電泳等方式對(duì)提取的總RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。選擇質(zhì)量及完整性較好的肌肉組織的總RNA，使用SMARTTMRACEcDNA Amplification Kit分別合成3’和5’RACE的cDNA第一鏈。從脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中獲得EcMHC2、EcMLC1基因部分EST序列，利用PrimerPremier 6.0軟件設(shè)計(jì)中間片段引物驗(yàn)證其準(zhǔn)確性后，設(shè)計(jì)3’和5’RACE特異性引物(見(jiàn)表2)。3’和5’RACE引物分別與UPM配對(duì)進(jìn)行cDNA的3’和5’末端擴(kuò)增。參照核酸凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后通過(guò)切膠回收得到擴(kuò)增目的片段，將目的片段與pEASY-T1載體連接，然后轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞TransT1中，過(guò)夜培養(yǎng)后，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑出陽(yáng)性單克隆，經(jīng)PCR檢測(cè)合格后送測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用DNAStar軟件SeqMan程序進(jìn)行拼接序列的拼接與組裝，得到2個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)。NCBI ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定其開(kāi)放閱讀框并預(yù)測(cè)氨基酸序列，利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)。用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)推測(cè)蛋白進(jìn)行基本理化參數(shù)分析；根據(jù)PredictProtein工具(https://www.predictprotein.org/)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能；InterProScan工具(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析結(jié)構(gòu)域。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstraps設(shè)為1 000次)。

1.4 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

將脊尾白蝦肌肉、眼柄、甲殼、胃、心臟、腸道、血細(xì)胞、卵巢、鰓和肝胰臟等組織及不同幼體發(fā)育時(shí)期、不同生長(zhǎng)階段的大個(gè)體組和小個(gè)體組的肌肉組織提取總RNA，按照TakaraPrime ScriptTMRTreagentKit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

Duan等[18]研究發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦18SrRNA作為內(nèi)參基因具有穩(wěn)定性，本研究根據(jù)脊尾白蝦18SrRNA(登錄號(hào)：GQ369794)序列設(shè)計(jì)熒光定量引物并利用geNorm程序，并對(duì)18SrRNA內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出基因表達(dá)穩(wěn)定性的平均值M，通常M<1.5為選擇閾值，認(rèn)為內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性較好。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果顯示不同組織間的M值為0.435，不同幼體生長(zhǎng)發(fā)育階段的M值為0.600，大小差異個(gè)體不同生長(zhǎng)階段的M值為0.479，表明選擇脊尾白蝦18SrRNA作為內(nèi)參基因具有較高的穩(wěn)定性。

根據(jù)脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1和內(nèi)參基因18SrRNA的開(kāi)放閱讀框cDNA序列，由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成熒光定量引物(見(jiàn)表2)。參照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ說(shuō)明書(shū)，利用ABI 7500 Real Time PCR儀器進(jìn)行熒光定量分析。10 μL反應(yīng)體系包括: 5 μL SYBR Premix Ex TaqTMII (2×)、0.2 μL ROX Reference Dye II (50×)、0.4 μL 10 μmol/L的正反向引物、3.0 μL去離子水、1.0 μL cDNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，收集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，每個(gè)循環(huán)增加0.5 ℃，收集熒光信號(hào)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算18SrRNA、EcMHC2、EcMLC1的熒光定量引物擴(kuò)增效率，根據(jù)公式E=10(-1/S)-1(S為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率)，計(jì)算可得其擴(kuò)增效率分別為103.2%、101.3%和102.7%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析，數(shù)據(jù)處理使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Origin Pro 9.0對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 EcMHC2、EcMLC1的cDNA全長(zhǎng)序列的獲得及氨基酸序列分析

3’RACE和5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物分別測(cè)序后與中間片段進(jìn)行拼接，獲得脊尾白蝦肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為EcMHC2、EcMLC1，GenBank登錄號(hào)為MG545144、MG545145。EcMHC2全長(zhǎng)5 929 bp，包括127 bp的5’端非編碼區(qū)(UTR)，72 bp的3’端非編碼區(qū)和5 727 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼1909個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為216.97 kD，理論等電點(diǎn)為5.62。EcMLC1全長(zhǎng)1 506 bp，包括69bp的5’端非編碼區(qū)(UTR)，975bp的3’端非編碼區(qū)和459 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼153個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為17.39 kD，理論等電點(diǎn)為4.64。3’端含有多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAAA和PolyA。

采用InterProScan分析蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，與其它肌球蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)相似，EcMHC2可分為頭區(qū)(81-778 aa)和尾區(qū)(844-1906 aa)，N端有一種選擇性結(jié)合多脯氨酸配體的結(jié)構(gòu)域Src同源區(qū)3(Src homology 3, SH3)(37-71 aa)(見(jiàn)圖1)。編碼的EcMLC1氨基酸序列經(jīng)InterProScan分析發(fā)現(xiàn)，在8-43aa處和82-117aa處各有1個(gè)可與Ca2+結(jié)合的EF-hand結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2)。Predict Protein分析發(fā)現(xiàn)EcMLC1具有46.41%的LOOP環(huán)和53.59%螺旋結(jié)構(gòu)。

(ATG起始密碼子；TAA終止密碼子；AATAAA多腺苷酸信號(hào)；“*”表示終止密碼子；劃線(xiàn)部分是結(jié)構(gòu)域Src同源區(qū)3；第一個(gè)實(shí)線(xiàn)框是頭區(qū)，第二個(gè)實(shí)線(xiàn)框是尾區(qū)。ATG is a start codon; TAA is a stop codon; AATAAA is a consensus polyadenylation signal; ‘*’represents no translation amino acid.SH3 is underlined; Head region and tail region are boxed in the first and second region, respectively.)

(ATG起始密碼子；TAA終止密碼子；AATAAA多腺苷酸信號(hào)；“*”終止密碼子；劃線(xiàn)區(qū)是EF-hand結(jié)構(gòu)。ATG is a start codon; TAA is a stop codon; AATAAA is a consensus polyadenylation signal; ‘*’represents no translation amino acid. EF-hand domain is underlined. )

2.2 EcMHC2、EcMLC1同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)BLAST同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦EcMHC2氨基酸序列與斑節(jié)對(duì)蝦MHC2(GenBank登錄號(hào)：BAM65720.1)的同源性最高為87%，因此本實(shí)驗(yàn)克隆所得肌球蛋白重鏈基因?yàn)棰蛐图∏虻鞍字劓湹腗HC2亞型；EcMLC1氨基酸序列與大西洋溝蝦(Palaemonvarians)MLC1(GenBank登錄號(hào)：ACR 54116.1)的同源性最高為96%，與克氏原鰲蝦MLC1(GenBank登錄號(hào)：ACR54116.1)的同源性為94%，因此，本實(shí)驗(yàn)克隆所得為Ⅱ型肌球蛋白堿性輕鏈的MLC1亞型。

利用MEGA 6.0軟件對(duì)MHC、MLC進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明顯示肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈在進(jìn)化上聚類(lèi)為兩大支脊索動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物。脊尾白蝦EcMHC2與斑節(jié)對(duì)蝦等十足目甲殼動(dòng)物聚為一支，EcMLC1與大西洋溝蝦等聚為一枝，然后與昆蟲(chóng)分支聚為一大枝；脊索動(dòng)物中被囊動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物聚為一支(見(jiàn)圖3)。

圖3 脊尾白蝦EcMHC2(A)、EcMLC1(B)氨基酸序列NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1的組織表達(dá)特征

利用熒光定量的方法檢測(cè)EcMHC2、EcMLC1在脊尾白蝦各個(gè)組織中的表達(dá)情況(見(jiàn)圖4)。結(jié)果顯示，EcMHC2、EcMHC2的組織表達(dá)量情況比較相似：在肌肉組織中的表達(dá)量最高，眼柄次之，而在其他組織中表達(dá)量均比較低(P<0.05)。

2.4 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1在受精卵和幼體發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征

如圖5所示，對(duì)比幼體發(fā)育各時(shí)期，受精卵時(shí)期脊尾白蝦體內(nèi)的EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量較低(P<0.05)。隨著幼體的發(fā)育，脊尾白蝦體內(nèi)的EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)，在仔蝦第1天達(dá)到最大(P<0.05)，然后表達(dá)量顯著下降。在脊尾白蝦溞狀幼體II期EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量顯著高于溞狀幼體發(fā)育的其它各時(shí)期(P<0.05)；在溞狀幼體Ⅵ期、Ⅴ期，EcMHC2的表達(dá)量無(wú)顯著性差異，但顯著高于Ⅲ期、Ⅳ期(P<0.05)。EcMLC1的表達(dá)量在蚤狀發(fā)育的5個(gè)時(shí)期(I、Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ和Ⅳ期)無(wú)顯著性差異。

2.5 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1在大小差異個(gè)體中的表達(dá)特征

在脊尾白蝦不同生長(zhǎng)階段，分別測(cè)定極大個(gè)體組(H組)和極小個(gè)體組(L組)的體長(zhǎng)、體重(見(jiàn)表1)。在脊尾白蝦生長(zhǎng)的四個(gè)階段中，EcMHC2在H組的表達(dá)量均顯著的高于L組；在60、80和120日齡時(shí)，H組的表達(dá)量均顯著的高于L組；100日齡時(shí)，EcMLC1表達(dá)量在H組與L組無(wú)顯著性差異。在H組和L組中，80日齡時(shí)EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量最高。

(不同小寫(xiě)字母表示EcMHC2和EcMLC1在不同組織的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of EcMHC2,EcMLC1 mRNA expressions in different tissues (P<0.05).)

(Oo. 受精卵時(shí)期；Z1.溞狀幼體Ⅰ期；Z2.溞狀幼體Ⅱ期；Z3.溞狀幼體Ⅲ期；Z4.溞狀幼體Ⅳ期；Z5.溞狀幼體Ⅴ期；Z6.溞狀幼體Ⅵ期；P1.仔蝦第1天；P5.仔蝦第5天；P10.仔蝦第10天。不同小寫(xiě)字母表示EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量在受精卵和幼體不同發(fā)育時(shí)期差異顯著(P<0.05).Oo. Oosperm, Z1.zoeaⅠ, Z2. zoeaⅡ, Z3.zoeaⅢ, Z4.zoeaⅣ, Z5.zoeaⅤ, Z6.zoeaⅥ, P1.postlarva-1, P5.postlarva-5, P10.postlarva-10. Different lowercase letters indicate significant difference of EcMHC2 and EcMLC1 mRNA expressions during oosperm and different early larval development stages (P<0.05).)

(不同小寫(xiě)字母表示EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量在不同組別不同生長(zhǎng)階段差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of EcMHC2 and EcMLC1 mRNA expressions during different group and stages (P<0.05).)

3 討論

3.1 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1氨基酸序列分析

本研究克隆獲得脊尾白蝦EcMHC2，具有Ⅱ型肌球蛋白家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)：由頭部區(qū)域和尾部區(qū)域組成，具有SH3結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合位點(diǎn)等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[19]。肌球蛋白重鏈的N-末端的頭部區(qū)域保守性較強(qiáng)是肌球蛋白家族的主要功能域，是肌球蛋白“分子馬達(dá)”功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)，具有ATP酶活性位點(diǎn)及與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，在肌肉收縮過(guò)程中，肌球蛋白重鏈和輕鏈相互纏繞形成肌球蛋白，通過(guò)使分子間構(gòu)型變化使肌球蛋白與ATP結(jié)合，引起頭部與肌動(dòng)蛋白結(jié)合減弱而使ATP水解產(chǎn)生能量，供頭部遷移、滑動(dòng)[20]。對(duì)不同的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)尾部結(jié)構(gòu)域差異較大，末端尾部呈卷曲螺旋形態(tài)，其主要在調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)中起作用。

細(xì)胞中最廣泛的存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，一般是由具有EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白參與執(zhí)行的[21]。EF-hand是一種由螺旋區(qū)-環(huán)-螺旋(Helix-loop-helix motif，HLH)構(gòu)型構(gòu)成的Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)，通常成對(duì)出現(xiàn)。每個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域是由12個(gè)殘基組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及兩側(cè)各12個(gè)堿基組成的α螺旋組成，而位于中央的環(huán)區(qū)是肌球蛋白輕鏈與Ca2+的結(jié)合區(qū)域。分析EcMLC1氨基酸結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與Ca2+結(jié)合的2個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)。對(duì)比其它4種甲殼動(dòng)物，包括大西洋溝蝦、褐蝦(Crangoncrangon)、克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)和日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)的MLC氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，都存在2個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)。EF-hands的結(jié)構(gòu)是由一個(gè)鈣離子結(jié)合域經(jīng)過(guò)4次串聯(lián)重復(fù)的方式進(jìn)化而來(lái)。在高等脊椎動(dòng)物中，肌球蛋白輕鏈和肌鈣蛋白C由同一個(gè)祖先進(jìn)化而來(lái)，均含有4個(gè)相似的能與Ca2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[22]，而無(wú)脊椎動(dòng)物的肌球蛋白輕鏈EF-hand結(jié)構(gòu)，由于在進(jìn)化過(guò)程中Ca2+結(jié)合所必需的氨基酸殘基發(fā)生突變，導(dǎo)致蛋白中某些EF-hand結(jié)構(gòu)失去了與Ca2+結(jié)合的能力[23-24]。

肌球蛋白是多基因家族具有不同的亞型，在哺乳動(dòng)物中，已發(fā)現(xiàn)的肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈分別有10余種亞型。甲殼動(dòng)物中，MHC1和MHC2在多種蝦類(lèi)中發(fā)現(xiàn)，且可能與幼體的發(fā)育有關(guān)[15]；MLC1和MLC3在堿性條件下容易從肌球蛋白分子上解離下來(lái)，故稱(chēng)堿性輕鏈[25]，其參與肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相互作用，而且MLC1和MLC3表達(dá)量的比值與肌肉收縮速率存在線(xiàn)性關(guān)系[26]。

3.2 脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1表達(dá)分析

脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1具有組織表達(dá)的特異性，通過(guò)熒光定量PCR分析可以看出EcMHC2、EcMLC1主要在肌肉中表達(dá)，其次是眼柄、甲殼，而在其它組織的表達(dá)量較低。在其它的動(dòng)物中MHC、MLC的表達(dá)模式也不盡相同，翹嘴鱖(Sinipercachuasti)MHC主要在紅肌中表達(dá)量最高，在其余組織中表現(xiàn)為中低表達(dá)[27]；凡納濱對(duì)蝦的MLC主要在肌肉中表達(dá)，其次是心臟和鰓組織，而在其它組織中的表達(dá)量較低[14]；桔小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)MLC在胸部的肌肉表達(dá)量顯著的高于其它組織[28]。MHC、MLC在不同的物種中主要的表達(dá)組織器官為肌肉組織的主要原因是肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈?zhǔn)羌⌒」?jié)粗肌絲的組成成分，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的重要基因，而次要的表達(dá)部位有所不同，可能的原因是是肌球蛋白的不同亞型的表達(dá)模式不同。

在無(wú)脊椎動(dòng)物中，對(duì)于調(diào)控肌球蛋白基因表達(dá)的機(jī)制研究很少，而在哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)中的大量研究表明其主要受體內(nèi)的一些重要的信號(hào)通路調(diào)節(jié)。研究表明鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路(CaN-NFAT)是一種受細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，NFAT進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其他的輔助因子結(jié)合后作用到特異的靶基因，從而促使肌球蛋白基因的表達(dá)[29]；MRF基因家族在調(diào)控肌球蛋白基因表達(dá)上起關(guān)鍵作用，在肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，MyoD起著總開(kāi)關(guān)的作用，特殊的結(jié)構(gòu)域與肌球蛋白等基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄激活[30]；Myogenin作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它的表達(dá)啟動(dòng)了一系列收縮蛋白如肌球蛋白重鏈的表達(dá)[31]；研究表明不同肌球蛋白重鏈基因之間存在的拮抗和促進(jìn)作用，MHC7b可以通過(guò)促進(jìn)miR-499的表達(dá)從而抑制MHC7的表達(dá)[32]，總之，肌球蛋白基因的表達(dá)受多種因子調(diào)控。

脊尾白蝦幼體的發(fā)育過(guò)程主要分為6個(gè)階段，在溞狀幼體Ⅱ期脊尾白蝦的特點(diǎn)是眼柄出現(xiàn)，并與頭胸甲分離，可以自由的轉(zhuǎn)動(dòng)[17]。在脊尾白蝦溞狀幼體II期EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量顯著高于溞狀幼體發(fā)育的其它各時(shí)期，而在組織表達(dá)分析中EcMHC2、EcMLC1在眼柄中的表達(dá)量也較高，推測(cè)EcMHC2、EcMLC1參與了脊尾白蝦眼柄發(fā)生過(guò)程。在轉(zhuǎn)為仔蝦的第一天，EcMHC2、EcMLC1的表達(dá)量顯著的高于幼體發(fā)育時(shí)期，這是由于仔蝦的形態(tài)習(xí)性與成蝦相似，同溞狀幼體的形態(tài)有很大的變化。變?yōu)樽形r后，脊尾白蝦開(kāi)始作水平游泳，游泳能力大大增強(qiáng)[33]，此時(shí)EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量的升高可能是由于其為肌肉生長(zhǎng)提供動(dòng)力。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對(duì)蝦幼體發(fā)育過(guò)程中，仔蝦MHC2表達(dá)量顯著高于幼體發(fā)育的其它時(shí)期[15]；在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，MHC2表達(dá)量與肌纖維形成的過(guò)程具有一致性[34]；在鱖魚(yú)幼體發(fā)育過(guò)程中，MLC1表達(dá)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[35]，暗示MHC2、MLC1可能在肌肉發(fā)育過(guò)程中起作用。

Hevroy等[36]發(fā)現(xiàn)大西洋鮭(Atlanticsalmon)的特定生長(zhǎng)率的高低與MHC的表達(dá)量有關(guān)；陳之航等[37]研究發(fā)現(xiàn)在翹嘴鱖早期生長(zhǎng)階段中，MHC在快長(zhǎng)組中的表達(dá)量大于慢長(zhǎng)組；Ren等[38]利用蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)挖掘與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)生長(zhǎng)相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)MHC、MLC在大個(gè)體組中表達(dá)上調(diào)；李文蘭等[14]發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦MLC的表達(dá)量在高速生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)顯著高于其它生長(zhǎng)時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)中，在脊尾白蝦孵化后60、80、100和120日齡，發(fā)現(xiàn)EcMHC2在極大個(gè)體組的表達(dá)量均顯著的高于極小個(gè)體組。在脊尾白蝦的4個(gè)生長(zhǎng)階段中，2個(gè)組的EcMHC2、EcMLC1表達(dá)量最高均在80日齡的脊尾白蝦。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了EcMHC2、EcMLC1表達(dá)水平的變化與物種的生長(zhǎng)進(jìn)程以及生長(zhǎng)速度有極大的相關(guān)性，為肌肉的生長(zhǎng)提供分子基礎(chǔ)，但MHC、MLC在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究克隆了脊尾白蝦EcMHC2、EcMLC1基因cDNA的全長(zhǎng)序列，并分析其在不同組織、不同幼體發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，以及大小差異個(gè)體在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)變化。研究結(jié)果表明EcMHC2、EcMLC1在脊尾白蝦肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，然而其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本研究為脊尾白蝦肌球蛋白功能的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為脊尾白蝦生長(zhǎng)相關(guān)基因的挖掘提供重要參考依據(jù)。