趙金龍 ，曾令烽 ，趙 第 ，潘建科 ，韓燕鴻 ，梁桂洪 ，李嘉暉 ，劉 軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院骨與關(guān)節(jié)退變及損傷研究團(tuán)隊(duì)，廣州 510120；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院，廣州 510120）

骨碎補(bǔ)首載于《藥性論》，是水龍骨科植物槲蕨的根莖部分。在中醫(yī)學(xué)的草藥應(yīng)用中，骨碎補(bǔ)用于多種骨傷科相關(guān)疾病，如肝腎不足引起的骨關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損等[1]。根據(jù)中國最新的人口普查數(shù)據(jù)，2013年中國60歲以上老年人口約為2.02億，而到2050年此數(shù)據(jù)可上升至4億，中國骨質(zhì)疏松患者或骨密度低的人群數(shù)量將達(dá)2.12億[2-3]，骨質(zhì)疏松癥病患人群的不斷增長，必然會(huì)帶來一系列的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)等壓力。因此充分利用和發(fā)掘可用于抗骨質(zhì)疏松的藥物，為抗骨質(zhì)疏松提供更有效的藥物成分，是社會(huì)和醫(yī)學(xué)發(fā)展的迫切要求。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)研究的發(fā)展以及臨床實(shí)踐的探索應(yīng)用，骨碎補(bǔ)也被發(fā)掘應(yīng)用于抗骨質(zhì)疏松治療[4]。Cai YL等[5]的研究顯示，骨碎補(bǔ)可以作用于去勢骨質(zhì)疏松大鼠，能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)小鼠的骨密度，并改善骨小梁的顯微結(jié)構(gòu)。臨床藥學(xué)中所應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松中成藥如強(qiáng)骨膠囊、骨疏康顆粒等，都包含有骨碎補(bǔ)這一味中藥成分[6]。骨碎補(bǔ)是中醫(yī)骨傷科廣泛應(yīng)用的經(jīng)典草藥，具有巨大的應(yīng)用潛力，探討并發(fā)掘骨碎補(bǔ)在抗骨質(zhì)疏松中的潛在機(jī)制，可有利于促進(jìn)抗骨質(zhì)疏松的臨床用藥進(jìn)展?；谙到y(tǒng)藥理學(xué)的生物信息學(xué)推導(dǎo)方法，對(duì)骨碎補(bǔ)的相關(guān)生物學(xué)、藥理學(xué)等生物信息數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將從分子層面及通路領(lǐng)域探討骨碎補(bǔ)治療骨質(zhì)疏松的生物學(xué)原理，以期為骨碎補(bǔ)的臨床推廣應(yīng)用及開發(fā)新的可用于抗骨質(zhì)疏松物藥提供有力的循證支持。

1 資料和方法

1.1 骨碎補(bǔ)的化學(xué)分子信息庫 本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP），以“骨碎補(bǔ)”作為中藥名檢索骨碎補(bǔ)的化學(xué)成分。

1.2 化合物的信息提取 通過口服方式表現(xiàn)出來的生物利用度是藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）中最重要的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的其中一個(gè)參數(shù)，其代表口服藥物到達(dá)體循環(huán)所占口服劑量的多少，作用比率高的口服生物利用度也許是決定生物活性分子類藥性的重要指標(biāo)[7]。文章研究以口服生物利用度（OB）最低大于或等于30%和類藥性（DL）最低大于或等于0.18作為活性化合物的選取標(biāo)準(zhǔn)，將數(shù)據(jù)庫中具有較高活性的成分進(jìn)行提取，以保證數(shù)據(jù)的有效性。

1.3 化合物與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)筑 將“骨碎補(bǔ)”相關(guān)的化合物及靶點(diǎn)通過軟件Cytoscape 3.5.1構(gòu)筑化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)的數(shù)據(jù)分析，從而研討骨碎補(bǔ)的藥理學(xué)作用機(jī)制，其中靶點(diǎn)度值（Degree）和中介中心度（Betweenness Centrality）是拓?fù)鋵W(xué)數(shù)據(jù)中兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，可評(píng)判該方劑相關(guān)化合物和靶標(biāo)的關(guān)鍵性。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 蛋白質(zhì)一般以相互組合的方式方能實(shí)現(xiàn)其生理學(xué)功能，因此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析及研究是理解生命活動(dòng)如生理過程等的基礎(chǔ)條件。為了闡明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)層面的用途，將“骨碎補(bǔ)”相關(guān)的靶點(diǎn)輸入數(shù)據(jù)庫STRING 10.5，使用相關(guān)設(shè)置功能，將評(píng)分設(shè)為0.90及以上，以此提升信息的可信性。通過以上數(shù)據(jù)處理而導(dǎo)出蛋白互作的可視化圖，并根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)提取相關(guān)靶標(biāo)蛋白的關(guān)聯(lián)頻數(shù)。

1.5 KEGG通路富集分析 KEGG（Kyoto Enclopedia of Genes and Genomes）是東京大學(xué)和日本京都大學(xué)共同開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，研究可以通過此信息庫進(jìn)行相關(guān)通路的研究，且該信息庫與David在線互聯(lián)。為了闡明本研究中方劑中相關(guān)化合物的靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用機(jī)制，文章采用David v6.8數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，從而分析骨碎補(bǔ)所涉及的相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 骨碎補(bǔ)的有效化合物數(shù)據(jù) 通過TCMSP共提取到骨碎補(bǔ)中有效化合物75種，以O(shè)B大于或等于30%及DL大于或等于0.18作為提取標(biāo)準(zhǔn)，篩選出活性化合物共18種，相關(guān)信息如表1所示。

2.2 骨碎補(bǔ)化合物-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò) 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中共計(jì)有185個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中化合物節(jié)點(diǎn)共計(jì)有14個(gè)、靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)171個(gè)）和608條邊，其中化合物分子以紅色節(jié)點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)注，藥物靶點(diǎn)以藍(lán)色節(jié)點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)注，每條邊代表化合物和靶點(diǎn)之間相關(guān)性，見圖1。其中共有4個(gè)化合物未進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)筑。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值的多少代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間相連邊的數(shù)量。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)的特點(diǎn)選取度值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行探討分析。表2顯示了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)相關(guān)結(jié)果如下：網(wǎng)絡(luò)集中度：0.328，網(wǎng)絡(luò)密度：0.018，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性：2.340，最短路徑：34040（100%）。平均度值結(jié)果：3.286486486，大于平均度值的節(jié)點(diǎn)共計(jì)24個(gè)；節(jié)點(diǎn)平均中介中心度：0.01225238，大于平均中介中心度的節(jié)點(diǎn)共計(jì)29個(gè)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值和中介中心度等拓?fù)鋵W(xué)特征選用核心節(jié)點(diǎn)分析。這些聯(lián)接化合物或靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中甚至起到?jīng)Q定性的作用，可能是核心的化合物或靶點(diǎn)。

表1 骨碎補(bǔ)化合物信息特征表Tab.1 Information characteristics of Gusuibu compound

圖1 化合物-靶標(biāo)關(guān)系圖Fig.1 Compound-target relationship diagram

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析最后表明骨碎補(bǔ)的核心化合物有柚皮苷（naringenin）、圣草酚（eriodictyol）、山奈酚（kaempferol）等；重要的靶標(biāo)有前列腺素G/H合成酶 2（Prostaglandin G/H synthase 2）、Heat shock protein HSP 90、Caspase-3等。

表2 化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)特征表Tab.2 Compound-target network node and topology feature table

柚皮苷（naringenin）是中藥骨碎補(bǔ)中的最主要成分之一，其為一種黃酮類化合物[8]，研究結(jié)果表明骨碎補(bǔ)中以柚皮苷為代表的黃酮類物質(zhì)是一種類雌激素類的單體成分[9]，具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)雌激素藥物在人體中發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。Pang等[10]研究結(jié)果表明柚皮苷這一具有類雌激素作用的單體成分，可能是激活城固細(xì)胞上配體依賴性的雌激素受體，從而發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松的作用，證明了柚皮苷在激素水平上抗骨質(zhì)疏松的作用。Wu JB等[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可促進(jìn)蛋白激酶B（Akt）的磷酸化、cfos及c-jun的激活而促進(jìn)BMP-2的表達(dá)，繼而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。Li等[12]提出，柚皮苷通過促進(jìn)相關(guān)成骨細(xì)胞的分化、促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨鈣蛋白表達(dá)，從而達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果證明[13]，柚皮苷具有較強(qiáng)的抗炎作用，其抗炎機(jī)制可能是主要通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的表達(dá)，而NF-κB的表達(dá)對(duì)于炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環(huán)氧合酶（COX-2）、白介素-6（IL-6）等均有促進(jìn)作用。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，柚皮苷能夠顯著減少外周血中的炎癥因子含量，減少了TNF-α的表達(dá)[14]。

山奈酚（kaempferol）一種存在于多種中藥材中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗骨質(zhì)疏松等多種生物功能[15]。相關(guān)研究結(jié)果表明，山奈酚對(duì)去卵巢大鼠具有較好的抗骨質(zhì)疏松治療作用，其研究發(fā)現(xiàn)山奈酚主要是通過抑制大鼠骨鈣的流失及骨吸收關(guān)鍵酶的活性，從而起到抗骨質(zhì)疏松作用[16]。通過抑制前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H synthase 2）的產(chǎn)生或釋放，也是抑制炎癥反應(yīng)的一種重要途徑。最新的研究結(jié)果顯示[17]，許多植物藥材的總黃酮等均可以降低炎癥組織中前列腺素G/H合成酶2的含量，其作用亦與抑制炎癥因子前列腺素G/H合成酶2的產(chǎn)生和釋放有關(guān)。Cox團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[18]，山奈酚可顯著性抑制前列腺素G/H合成酶2的產(chǎn)生[19]。

前列腺素 G/H合成酶 2（Prostaglandin G/H synthase 2）是一個(gè)與細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素[20]。中性粒細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥的其中一個(gè)機(jī)制是促進(jìn)Prostaglandin G/H synthase 2的分泌[21]。前列腺素G/H合成酶2又稱COX-2，是一種誘導(dǎo)性酶，在大多細(xì)胞中少量表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到促癌劑、促炎細(xì)胞因子等刺激時(shí)，COX-2表達(dá)會(huì)上調(diào)，進(jìn)而參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展[22]。許多研究結(jié)果表明，下調(diào)COX-2可以減輕炎癥反應(yīng)[23-24]。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的細(xì)胞凋亡活化復(fù)合體激活，其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是軟骨細(xì)胞凋亡調(diào)控的中心執(zhí)行者[25]。Caspases是一種具有切割蛋白供血的生物酶，這種酶會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)崩解，包括始動(dòng)因子Caspase2、8、9及執(zhí)行因子 Caspase 3、6、7[26]，Caspase3 被激活，細(xì)胞死亡將不可被逆轉(zhuǎn)[27]。劉嘉眉等[28]探討Caspase 3、9與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的影響的研究顯示，在骨質(zhì)疏松癥組中的案例Caspase-3、Caspase-9含量增加，這表明在骨質(zhì)疏松癥組的成骨細(xì)胞凋亡過程中，Caspase依賴性凋亡途徑激活。有相關(guān)研究結(jié)果表明[29]，藥物的干預(yù)可以誘導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路及Caspases的激活來引導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡，這也可能提示筆者，可能骨碎補(bǔ)等中藥或其單體成分是通過Caspase-3等執(zhí)行因子的作用，誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞凋亡，如成骨細(xì)胞等，這可能會(huì)促進(jìn)骨質(zhì)疏松的進(jìn)展，同時(shí)也給予相關(guān)研究者予提示，通過干預(yù)相關(guān)Caspase-3等執(zhí)行因子或啟動(dòng)因子，從而起到阻斷成骨細(xì)胞凋亡等作用，進(jìn)而阻礙骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展，起到抗骨質(zhì)疏松的作用。另有研究顯示，杜仲葉中的抗氧化活性物質(zhì)，可通過抑制Caspases 3、9等的表達(dá)，拮抗H2O2誘導(dǎo)的前成骨細(xì)胞MC3T3-E的凋亡，從而起到促進(jìn)抗骨質(zhì)疏松的作用。經(jīng)過生物信息學(xué)的分析，Caspase-3這一靶點(diǎn)占據(jù)重要的地位，可能骨碎補(bǔ)發(fā)揮類似杜仲通過抑制成骨細(xì)胞的凋亡，從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用。

2.3 骨碎補(bǔ)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 為了更好地理解與分析骨碎補(bǔ)的作用機(jī)制及原理，基于蛋白之間相互作用的關(guān)系，利用STRING構(gòu)造了“骨碎補(bǔ)”相關(guān)靶標(biāo)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。設(shè)置置信度大于或等于0.90，去除孤立于網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)靶標(biāo)蛋白，得到的PPI網(wǎng)絡(luò)共計(jì)126個(gè)節(jié)點(diǎn)，1058條邊，平均度值：8.396825，其中節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)蛋白，每條邊表示靶標(biāo)蛋白之間的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值繪制大于平均度值且度值較高的22個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的表格和雷達(dá)圖（見表3和圖3）。度值較高的5位分別為 JUN、TP53、MAPK1、RELA、AKT1。其中 JUN度值（度值為39）高于其他節(jié)點(diǎn)，說明這個(gè)蛋白在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了相對(duì)重要的作用，成為聯(lián)通網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

圖2 骨碎補(bǔ)靶蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Target protein interaction network diagram of Gusuibu

表3 靶標(biāo)蛋白名稱及其度值Tab.3 Target protein names and degree values

圖3 靶標(biāo)蛋白頻次雷達(dá)圖Fig.3 Target protein frequency radar map

PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明 JUN、TP53、MAPK1、IL-6、ESR1等靶蛋白度值遠(yuǎn)高于其它。c-jun蛋白水平的循環(huán)變化在腺上皮細(xì)胞的增殖和凋亡中是顯著的。c-jun蛋白的持續(xù)基質(zhì)表達(dá)可以防止基質(zhì)細(xì)胞在晚期分泌期進(jìn)入細(xì)胞凋亡[30]。RelA/p65為NF-Kβ的亞單位，且在炎癥反應(yīng)及炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的過程中有著重要的影響。NF-κB能夠引導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2、6、12等，從而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[31]。研究顯示[32-33]，外源性物質(zhì)刺激生物體可以引起機(jī)體TNF-α和白細(xì)胞介素6等促炎因子的分泌，從而抗炎因子水平會(huì)降低，因而引起細(xì)胞因子水平的不平衡等，最終使得體內(nèi)炎癥的發(fā)生及發(fā)展。而近來的研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展，與炎癥的內(nèi)在聯(lián)系愈加緊密，LI-6、白介素-2（IL-2）等炎癥因子均能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)骨吸收，從而促使骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[34-36]。由此推測骨碎補(bǔ)可能是通過作用于JUN、RELA等靶蛋白，從而調(diào)整IL-2等促炎因子在體內(nèi)的生物學(xué)活動(dòng)，起到抗炎等生理功能，這與骨碎補(bǔ)在臨床上與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上應(yīng)用于炎癥的干預(yù)相一致，從機(jī)制理論和臨床實(shí)際應(yīng)用兩個(gè)層面證實(shí)了其抗炎作用。

雌激素受體1基因（ESR1）位于人染色體6q21上，雌激素與雌激素受體（ER）相互結(jié)合，可以介導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)，從而參與骨的重構(gòu)，同時(shí)相關(guān)結(jié)果也表明，ESR1與骨密度關(guān)系密切[37]。另有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[38]，ESR1活化能夠抑制相關(guān)通路的磷酸化，由此可以促進(jìn)自噬、抑制凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而維持或促進(jìn)骨量或軟骨的優(yōu)勢變化。骨丟失、骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展和雌激素受體α蛋白表達(dá)異常相關(guān)，因此雌激素受體α蛋白表達(dá)異常，也會(huì)影響到ER的相關(guān)生物學(xué)進(jìn)程，進(jìn)而對(duì)人體的骨密度產(chǎn)生影響，推動(dòng)或阻斷骨質(zhì)疏松的發(fā)展進(jìn)程[39]。Qu等[40]發(fā)現(xiàn)在成骨細(xì)胞上存在雌激素受體，在小鼠骨髓培養(yǎng)過程中，雌激素可通過ER依賴方式刺激成骨細(xì)胞的分化，從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用。Oreffo等[41]發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞前體中有ESR1表達(dá)，但在破骨細(xì)胞成熟和進(jìn)行骨吸收時(shí)ESR1表達(dá)消失，表明雌激素受體的表達(dá)和調(diào)控可能在破骨細(xì)胞的形成中發(fā)揮重要作用，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的控制表現(xiàn)為抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成。

2.4 KEGG通路富集分析 使用David v6.8數(shù)據(jù)庫對(duì)骨碎補(bǔ)靶蛋白基因進(jìn)行信息通路富集，結(jié)果共有139條生物信息通路，計(jì)算每條富集通路的P值（P值小于0.01為顯著富集），去除部分具有普遍性和廣泛性的生物學(xué)通路，提取與骨碎補(bǔ)治療骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的或有可能成為關(guān)鍵途徑的生物學(xué)通路，并對(duì)其P值排序后取前10名進(jìn)行分析。見表4。

表4 KEGG通路富集情況表（Top 10）Tab.4Outcome of KEGG pathway enrichment（Top 10）

為了更深層次探究骨碎補(bǔ)作用靶點(diǎn)在生物信號(hào)通路層面的機(jī)制，文章利用KEGG通路富集對(duì)骨碎補(bǔ)靶標(biāo)基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的10條相關(guān)通路分別是TNFsignalingpathway、T cell receptor signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、PI3K-Aktsignalingpathway、Estrogensignaling pathway、Neurotrophin signalingpathway、Thyroid hormone signaling pathway、FoxO signaling pathway、cAMP signaling pathway、VEGF signaling pathway。由上述KEGG富集結(jié)果分析可知，骨碎補(bǔ)與TNF signalingpathway、PI3K-Aktsignaling pathway、Estrogen signaling pathway、cAMP signaling pathway、VEGF signaling pathway等相關(guān)通路有較大聯(lián)系。因此文章試圖從以上幾個(gè)主要方面進(jìn)行機(jī)制探討與分析，試圖理解骨碎補(bǔ)在基因功能及信號(hào)通路層面的作用機(jī)制。

TNF signaling pathway經(jīng)TNF與TNFR1結(jié)合而激活，激活的TNF信號(hào)通路可導(dǎo)致NF-κB核易位和JNK，p38，AP-1活化，促使促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和TNF-α本身等基因的表達(dá)[42]。近年來，許多研究認(rèn)為，骨質(zhì)疏松可能不僅與內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂，如雌激素缺乏等相關(guān)，同時(shí)也提出觀點(diǎn)：骨質(zhì)疏松癥的生化進(jìn)展與免疫系統(tǒng)功能失常而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)有直接關(guān)系[34]。許多炎性細(xì)胞因子如TNF、NF-κB 受體活化因子配體（RANKL）、IL-2、IL-6等參加了各類骨質(zhì)疏松癥的生化進(jìn)展，同時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[43-44]。而炎性細(xì)胞因子促進(jìn)骨吸收或降低骨形成來打破骨轉(zhuǎn)換平衡，參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展，因此阻斷炎癥反應(yīng)已成為防治骨質(zhì)疏松的重要靶點(diǎn)與途徑。在利用STRING10.5數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行PPI分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)，TNF、IL-6、IL-2、RELA等靶蛋白的度值比較高。因此，骨碎補(bǔ)可能是通過其獨(dú)特的化合物或單體成分，通過TNF signaling pathway這一信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用而起到抗骨質(zhì)疏松的生化作用。

Estrogen signaling pathway亦可能是骨碎補(bǔ)發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松作用的最重要通路之一。雌激素通過相關(guān)受體激活途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制成骨細(xì)胞上存在腫瘤壞死因子受體等，且在成骨細(xì)胞的功能發(fā)揮中起重要作用，TNF-α等均屬于TNF超家族，許多實(shí)驗(yàn)表明[45]誘導(dǎo)活化成骨細(xì)胞胞膜上受體Fas等可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，因此骨碎補(bǔ)相關(guān)有效成分可能通過Estrogen signaling pathway減少成骨細(xì)胞胞膜上受體Fas等受體的活化，從而減少成骨細(xì)胞凋亡，至少阻斷或延緩了骨質(zhì)疏松平衡的加快打破。研究表明[45]成骨細(xì)胞上存在雌激素受體，在小鼠骨髓培養(yǎng)過程中，雌激素可通過ER依賴方式刺激成骨細(xì)胞的分化，從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用，因此骨碎補(bǔ)有關(guān)成分，可能是通過Estrogen signaling pathway調(diào)控相關(guān)成骨細(xì)胞上的ER，從而促進(jìn)鈣鹽等的沉積，促進(jìn)骨形成，從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用。

3 討論

文章運(yùn)用系統(tǒng)藥理學(xué)的方法對(duì)骨碎補(bǔ)的作用機(jī)制及原理進(jìn)行分子機(jī)制、基因及信號(hào)通路等層面的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)在抗骨質(zhì)疏松治療方面具有很強(qiáng)的科學(xué)性，由化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析可知其可能是通過柚皮苷等黃酮等類雌激素類化合物發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松的生物學(xué)作用。由PPI分析、David通路富集分析可知骨碎補(bǔ)在理論上具有從抗炎、內(nèi)分泌系統(tǒng)等途徑發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。此外，通過相關(guān)的生物學(xué)信息分析，筆者發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)與 Neurotrophin signaling pathway、Thyroid hormone signaling pathway、FoxO signaling pathway 等生物學(xué)通路關(guān)系密切，可能與骨質(zhì)疏松有一定的關(guān)聯(lián)，但目前關(guān)于這方面的研究尚少，因此骨碎補(bǔ)是否與以上通路存在一定的生物學(xué)聯(lián)系以及在以上通路發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的效用，尚需大量的臨床、實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行探索驗(yàn)證，同時(shí)本課題為以后基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及藥物開發(fā)提供了一個(gè)新方向。