黃海超，竇昊穎，梁芳芳，王泓午

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津市口腔醫(yī)院，天津 300041）

糖尿病發(fā)生的一個必經(jīng)階段，稱為“糖尿病前期”，包括糖耐量受損（IGT）和/或空腹血糖受損（IFG）[1]。其中，IGT患者存在明顯的胰島素抵抗及分泌障礙，是糖尿病的危險人群[2]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病前期可增加腎臟、神經(jīng)、視網(wǎng)膜及大血管病變的風險[3-6]。因此，對IGT患者進行有效的干預可阻止糖尿病進展，對糖尿病防治將起到重大作用。肥甘厚膩飲食是引發(fā)IGT甚至2型糖尿?。═2DM）的重要原因之一[7]，以陰虛熱盛和濕熱困脾為主[8-9]。前期研究已證實[10-11]，氣虛和痰濁是T2DM主要的證候，氣虛貫穿于糖尿病前期和T2DM病程的始終。T2DM以氣陰兩虛型和濕熱困脾型為主，而糖尿病前期則以陰虛內熱、濕熱困脾為主。脾主運化、統(tǒng)血，輸布水谷精微，喜燥惡濕，脾虛則氣不足，堆積不能運化，淤積于體內助濕生痰。因此，按照益氣補陰，補氣益脾，清熱除濕的治則可預防高脂高糖飲食引起的IGT向T2DM演變。本研究選取黃芪、茵陳蒿和荷葉三藥配伍組成芪茵荷葉飲，并采用正交實驗研究其能否預防IGT向T2DM演變，并從NF-κB信號通路入手，探明芪茵荷葉飲預防IGT向T2DM演變的作用機制。

1 材料

1.1 動物 4～5周齡清潔級SD雄性大鼠，體質量150～180 g，共110只。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器 羅氏活力型血糖檢測儀和血糖試紙，大鼠胰島素ELISA試劑盒（上海寶曼生物科技有限公司）。HWY-100C恒溫培養(yǎng)箱，Bio-Rad iMark酶標儀，EnSpire酶標儀。

1.3 藥物制備 芪茵荷葉飲由黃芪、茵陳蒿和荷葉按比例配制，在天津中醫(yī)藥大學實驗中心煎煮。每克中藥加水6 mL浸泡30 min，武火煮沸后轉文火煎煮30 min，過濾后收集煎液，原渣每克加水4 mL煎煮40 min，合并兩次煎液，于60℃水浴濃縮成每毫升制劑相當于生藥1 g，置4℃冰箱備用。給藥前復溫至25～30℃。

2 方法

2.1 造模方法[12]150～180 g清潔級雄性SD大鼠180只適應性喂養(yǎng)1周，隨機抽取10只作為對照組（N）給予基礎飼料喂養(yǎng)（碳水化合物65.42%，蛋白質占22.47%，脂肪占12.11%），其余為IGT造模組，給予45%的高脂高糖飼料（碳水化合物占35%，蛋白質占20%，脂肪占45%）。所有飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。實驗期間各組大鼠自由飲水，每日投食1次。喂養(yǎng)12周時，IGT造模組禁食12 h后，經(jīng)鼠尾采血測空腹血糖（FBG），以50%葡萄糖注射液2 g/kg體質量灌胃，2 h后再次鼠尾采血測OGTT 2 h血糖（2 h PG），以 3.9 mmol/L≤FBG＜6.1 mmol/L，7.8 mmol/L≤2 h PG＜11.1 mmol/L 并持續(xù)1周以上為造模成功，成模率60%。

2.2 分組及給藥方法 將100只建模成功的大鼠隨機分為模型組 1組和實驗組 9組（A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I），設對照組 1 組，共 11 組，每組10只。按照《中國藥典》給藥劑量，進行大鼠與人體等效劑量換算后的劑量為中劑量，低劑量為中劑量一半，高劑量為中劑量的兩倍。9組實驗組用藥劑量配伍按正交表L9（34）設計，見表1。水煎混合懸液灌胃，模型組和對照組生理鹽水灌胃，各組灌胃體積相同，每日1次，持續(xù)12周。灌胃期間各組大鼠均普通飼料喂養(yǎng)。

表1 正交實驗設計表Tab.1Qiyin Heye Decoction L9（34）orthogonal experimental factor level

2.3 指標檢測方法

2.3.1 血清指標檢測 分別在給藥前、給藥6周和給藥12周，大鼠禁食12 h后采用葡萄糖氧化酶法測FBG、采用酶聯(lián)免疫分析法空腹胰島素（FINS）水平。計算HOMA胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG×FINS/22.5。

2.3.2 骨骼肌取材 給藥12周后取大鼠后肢骨骼肌樣本，凍存于-80℃冰箱，待指標檢測。

2.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色 將肌肉組織切片經(jīng)蘇木素浸染5 min左右，水洗l min，75%的鹽酸乙醇分化30 s，水洗，氨水處理30 s，水洗1 min，酸化伊紅乙醇液染12 min，流水快速沖洗、脫水、透明、封片固定。

2.3.4 實時熒光定量PCR檢測方法 應用實時熒光反轉錄-多聚酶鏈反應（RT-PCR）檢測NF-κB信號通路節(jié)點基因相關mRNA含量。采用Trizol法提取骨骼肌總RNA，反轉錄為cDNA，反轉錄條件為37℃15 min，85℃5 s。熒光定量PCR儀進行基因表達量的檢測，2-ΔΔCt法對 Real-time PCR 結果進行定量分析。擴增條件為預變性95℃30 s，擴增反應為95℃5 s，60℃34 s，反復40個循環(huán)。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，GAPDH作為內參照，GAPDH上游引物為：5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’；下游引物為：5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’；NF-κBp65 上 游 引物為：5’-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3’，下游引物為：5’-CACTGTCACCTGGAAGCAGA-3’；IκB-α 上游引物為：5’-TTGGTCAGGTGAAGGGAGAC-3’，下游引物為：5’-GCTTTCAGAAGTGCCTCAGC-3’。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，正交實驗采用直觀分析和正交設計方差分析，重復測量資料采用重復測量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對大鼠空腹葡萄糖的影響 給藥期各組大鼠空腹葡萄糖重復測量方差分析主效應結果顯示：Mauchly球形檢驗P=0.326，滿足“球對稱”。不考慮時間因素，實驗各組大鼠空腹葡萄糖有統(tǒng)計學意義（F組間=4.269，P=0.000）。不考慮干預因素，各組大鼠空腹葡萄糖隨時間變化而變化（F時間=110.670，P=0.000）。時間與組別交互效應結果顯示，實驗各組大鼠空腹葡萄糖隨時間的變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義（F交互=3.240，P=0.000）。各組大鼠空腹葡萄糖變化情況：給藥6周時除實驗I組外其余各組血糖值均較給藥前降低，其中實驗E組下降最明顯，與模型組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。給藥12周時，各實驗組FBG值均反彈，其中實驗B組和E組均較模型組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 芪茵荷葉飲對大鼠空腹葡萄糖的影響（）Tab.2 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

表2 芪茵荷葉飲對大鼠空腹葡萄糖的影響（）Tab.2 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組實驗A組實驗B組實驗C組實驗D組實驗E組實驗F組實驗G組實驗H組實驗I組動物數(shù)10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10時間第0周 第6周 第12周4.46±1.35* 4.81±0.73 6.00±0.42 6.11±0.72 4.82±0.46 6.17±0.41 5.76±1.22 4.36±0.45 6.44±0.32 5.68±0.59 4.94±0.35 7.05±0.99*6.08±0.78 4.86±0.55 6.41±1.02 5.85±0.26 5.23±0.48 5.73±0.58 6.11±0.74 4.23±0.54* 7.02±1.34*5.70±0.56 4.61±0.41 6.11±0.47 5.43±0.67 4.59±0.42 6.35±0.78 5.87±0.50 4.48±0.72 6.61±0.93 5.73±0.56 6.09±0.66* 6.92±0.93

3.2 芪茵荷葉飲對大鼠血清胰島素的影響 給藥期各組大鼠FINS重復測量方差分析主效應結果顯示：Mauchly球形檢驗P=0.037，不滿足“球對稱”，采用校正法。不考慮時間因素，實驗各組大鼠FINS有統(tǒng)計學意義（F組間=13.922，P=0.000）。不考慮干預因素，各組大鼠FINS隨時間變化而變化（F時間=286.082，P=0.000）。時間與組別交互效應結果顯示，實驗各組大鼠FINS隨時間的變化趨勢差異有顯著性（F交互=5.118，P=0.000），各組FINS隨時間變化的趨勢不一致。各組大鼠FINS變化：給藥6周時各組FINS均較模型組降低，且有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。給藥12周時各組FINS水平均較給藥6周時升高，但各實驗組（除A和B組）較模型組降低差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3.3 芪茵荷葉飲對大鼠HOMA-IR的影響 給藥期各組大鼠HOMA-IR重復測量方差分析主效應結果顯示：Mauchly球形檢驗P=0.335，滿足“球對稱”。不考慮時間因素，各組大鼠HOMA-IR有統(tǒng)計學意義（F組間=8.784，P=0.000）。不考慮干預因素，各組大鼠HOMA-IR隨時間變化而變化（F時間=247.592，P=0.000）。時間與組別交互效應結果顯示，實驗各組大鼠HOMA-IR隨時間的變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義（F交互=2.631，P=0.001），各組 HOMA-IR 隨時間變化的趨勢不一致。各組大鼠HOMA-IR變化情況：給藥6周時除實驗B組、C組及I組外，其余各組HOMA-IR均較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。給藥12周，實驗D組、F組、G組、H組和I組HOMA-IR均較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表 4。

表3 芪茵荷葉飲對大鼠血清胰島素的影響（）Tab.3 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

表3 芪茵荷葉飲對大鼠血清胰島素的影響（）Tab.3 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組實驗A組實驗B組實驗C組實驗D組實驗E組實驗F組實驗G組實驗H組實驗I組動物數(shù)10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10時間第0周 第6周 第12周49.41±5.42 22.99±3.44* 35.69±7.51*46.50±4.62 36.34±3.00 43.77±3.02 43.87±5.93 32.24±3.01* 39.42±1.86 43.01±5.72 32.16±3.54* 39.23±5.49 42.05±2.56 32.40±2.20* 36.55±2.76*41.55±6.03 29.17±3.81* 37.75±5.84*41.20±4.05 21.75±3.12* 32.05±4.15*45.26±9.55 20.73±2.72* 33.00±4.13*44.56±3.42 19.19±4.34* 28.28±2.06*39.34±6.41 21.86±4.67* 28.17±3.24*40.94±6.80 27.80±0.75* 28.67±6.10*

表4 芪茵荷葉飲對大鼠HOMA-IR的影響（）Tab.4 Effect of QYHYD on HOMA-IR among eleven rats（）

表4 芪茵荷葉飲對大鼠HOMA-IR的影響（）Tab.4 Effect of QYHYD on HOMA-IR among eleven rats（）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組實驗A組實驗B組實驗C組實驗D組實驗E組實驗F組實驗G組實驗H組實驗I組動物數(shù)10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10時間第0周 第6周 第12周9.73±2.91* 4.90±1.02* 9.57±2.35*12.56±1.37 7.83±1.29 12.00±1.14 11.00±1.21 6.27±0.88* 11.29±0.87 10.75±0.96 7.06±0.98 12.28±2.27 11.37±1.73 6.96±0.40 10.50±2.41 10.85±1.96 6.75±0.96* 9.63±1.97*11.17±1.65 4.08±0.92* 10.09±2.64 11.55±2.86 4.17±0.50* 8.99±1.53*10.65±0.60 3.95±1.22* 7.93±0.77*10.26±1.88 4.37±1.32* 8.25±1.30*10.38±1.84 7.43±0.92 8.82±2.08*

3.4 芪茵荷葉飲正交實驗結果 給藥12周時正交結果極差分析和方差分析顯示，對FBG影響的主次因素為茵陳蒿＞黃芪＞荷葉，最佳配伍方案為中劑量黃芪+高劑量茵陳蒿+高劑量荷葉；對FINS影響的主次因素為黃芪＞荷葉＞茵陳蒿，最佳配伍方案為高劑量黃芪+高劑量茵陳蒿+中劑量荷葉；對HOMAIR影響的主次因素為茵陳蒿＞黃芪＞荷葉，最佳配伍方案為低劑量黃芪+低劑量茵陳蒿+低劑量荷葉。方差結果分析顯示，不同劑量的茵陳蒿對FBG影響存在統(tǒng)計學差異，不同劑量黃芪對FINS和HOMA-IR存在統(tǒng)計學差異。見表5、表6。

表5 第12周正交實驗結果極差分析Tab.5 Range analysis of orthogonal experimental results at week 12

表6 第12周正交實驗結果方差分析（）Tab.6 ANOVA of orthogonal experimental results at week 12（）

表6 第12周正交實驗結果方差分析（）Tab.6 ANOVA of orthogonal experimental results at week 12（）

注：*P<0.05。

藥物 劑量 FBG FINS HOMA-IR images/BZ_28_1041_804_1099_841.png F images/BZ_28_1041_804_1099_841.png F images/BZ_28_1041_804_1099_841.png F黃芪 低 6.63±0.91 1.03 38.40±4.03 27.61*11.359±2.159 12.73*中 6.26±1.05 34.42±5.44 9.570±2.145高 6.65±0.91 28.38±4.17 8.370±1.531茵陳蒿 低 6.14±0.69 3.21*35.60±6.14 1.85 9.695±1.914 0.87中 6.88±1.12 32.92±6.43 10.120±2.736高 6.50±0.91 32.56±5.64 9.408±2.181荷葉 低 6.40±0.67 0.35 33.29±5.74 2.35 9.451±1.828 1.05中 6.55±1.03 35.04±7.43 10.154±2.540高 6.61±1.17 32.49±4.74 9.586±2.490

3.5 骨骼肌組織病理學變化 給藥12周末，大鼠肌肉組織HE染色結果顯示：對照組大鼠骨骼肌形態(tài)完整、肌纖維排列整齊；模型組及9組實驗組大鼠骨骼肌肌纖維排列紊亂、均有水腫，模型組水腫較為明顯、可見炎癥細胞浸潤，見圖1。

3.6 芪茵荷葉飲對大鼠骨骼肌 IκB-α及NF-κBp65mRNA的影響 給藥期間各實驗組大鼠骨骼肌IκB-α表達經(jīng)方差分析具有統(tǒng)計學差異（F=51.819，P<0.01），其中實驗H組IκB-α明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義。各組大鼠NF-κBp65mRNA方差分析結果顯示具有統(tǒng)計學差異（F=51.819，P<0.01）。與實驗 M 組相比，A、C、G 3 組 NF-κBp65 下降，其中G組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表7。

圖1 大鼠骨骼肌病理組織學變化Fig.1 Histopathological changes of skeletal muscle among groups of rats

表7 芪茵荷葉飲對大鼠IκB-α和NF-κBp65 mRNA表達的影響（）Tab.7 Effect of QYHYY on the expression of IκB-α and NF-κBp65 mRNA among eleven rats（）

表7 芪茵荷葉飲對大鼠IκB-α和NF-κBp65 mRNA表達的影響（）Tab.7 Effect of QYHYY on the expression of IκB-α and NF-κBp65 mRNA among eleven rats（）

注：與模型組比較，*P<0.01。

組別對照組模型組實驗A組實驗B組實驗C組實驗D組實驗E組實驗F組實驗G組實驗H組實驗I組F值動物數(shù)10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 IκB-α NF-κBp65 3.39±4.42 2.12±2.73*0.29±0.45 0.14±0.29 0.14±0.08 0.04±0.03 0.72±2.07 0.81±2.31 0.26±0.24 0.09±0.12 0.77±0.90 0.21±0.29 0.86±1.22 0.36±0.56 4.97±7.18 1.83±2.62 0.02±0.02* 0.01±0.01*5.77±4.79* 2.70±3.45 5.76±6.91 1.74±2.19 51.819* 54.215*

4 討論

IGT是消渴癥的前驅狀態(tài)，中醫(yī)稱之為脾癉。《圣濟總錄·消渴》中記有：“消癉者，膏粱之疾也，肥美之過，積為脾癉，癉病既成。”飲食失節(jié)、勞逸失調，則脾運不健，水谷運化失司，痰濕凝聚，燥熱內生。因此，按照補氣益脾，清熱除濕的治療原則對高脂高糖飲食引起的IGT患者進行干預，可有效預防IGT向T2DM演變。據(jù)此自擬芪茵荷葉飲，本方中黃芪性味甘溫、歸肺、脾經(jīng)，具有益氣補虛功效，現(xiàn)代藥理學研究也表明黃芪具有降血糖、降血脂之功效[13]，是中醫(yī)臨床常用的降糖組方用藥。茵陳蒿，性微寒味苦，歸脾、胃、肝和膽經(jīng)，具有清利濕熱之效，研究表明茵陳蒿中的有效化合物β-谷甾醇、槲皮素等可通過多條信號通路作用于靶標蛋白發(fā)揮其抗炎、降脂作用[14-15]。荷葉，性微溫平味辛，歸肝、脾經(jīng)，清熱除濕、利水通便，適用痰濕體質，荷葉具有降脂抗氧化之功效[16]。

本研究通過高糖高脂飲食誘導的方法，成功構建了IGT大鼠模型，造模成功的大鼠出現(xiàn)了血糖升高、糖耐量受損等癥狀。給予芪茵荷葉飲干預6周后，除實驗I組外其余各干預組FPG均有所下降，其中實驗 E 組具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）；干預12周時FPG較干預6周時回升，除實驗D組外均超過干預前水平，D組為唯一低于干預前水平組別，說明芪茵荷葉飲對IGT大鼠FPG具有調節(jié)作用，可能為高劑量茵陳蒿發(fā)揮主要作用，但調節(jié)血糖效果不穩(wěn)定，仍需延長觀察時間以確定療效。FINS水平與胰島β細胞功能、血糖的穩(wěn)定以及T2DM發(fā)生發(fā)展密切相關，研究表明IGT的發(fā)生與FINS濃度的進一步增加有關[17]。本研究干預6周時FINS下降，12周時略有回升但均未達到給藥前水平，說明芪茵荷葉飲可通過調節(jié)FINS改善β胰島細胞功能。HOMA-IR可以反映胰島素抵抗狀態(tài)和胰島素敏感性，指數(shù)隨胰島素抵抗程度增加而升高。本研究中模型組大鼠HOMA-IR上升，出現(xiàn)IR狀態(tài)，而經(jīng)芪茵荷葉飲干預6周和12周后，部分實驗組HOMA-IR較模型組下降，且除A和B組外均低于給藥前水平，說明芪茵荷葉飲在保護胰島β細胞、改善胰島功能、減輕胰島素抵抗方面具有一定功效。

正交實驗結果提示，僅不同劑量茵陳蒿對FBG影響存在統(tǒng)計學差異，茵陳蒿取高劑量效果最佳；僅不同劑量黃芪對FINS和HOMA-IR存在統(tǒng)計學差異，黃芪取低劑量效果最佳。荷葉對3項指標的影響均不顯著，從經(jīng)濟學角度可取低劑量。綜合分析，黃芪為君、茵陳蒿為臣、荷葉為輔，低劑量黃芪、高劑量茵陳蒿配伍低劑量荷葉為最優(yōu)方案。

本研究病理切片顯示模型組大鼠骨骼肌組織水腫、有炎癥細胞浸潤，說明IGT大鼠骨骼肌存在炎性反應。研究表明，糖尿病前期就可能已經(jīng)存在炎性反應[18]。骨骼肌是機體慢性炎癥發(fā)生、發(fā)展的重要組織，骨骼肌慢性炎癥是T2DM發(fā)病的早期分子事件[19]。胰島素抵抗是IGT的主要表現(xiàn)，長期高脂飲食引起體重增加，可使體內炎性因子分泌增加、炎癥信號通路激活，從而誘發(fā)胰島素抵抗，導致骨骼肌穩(wěn)態(tài)失調、肌組織結構受損[20]。

NF-κB是重要轉錄激活因子，在靜息狀態(tài)下IκBα與NF-κB雜二聚體以結合形式位于細胞質中，抑制NF-κB活化。當機體受到某些外界刺激時，IκBα 磷酸化從 NF-κB 二聚體解離，NF-κB 活化并進入細胞核，調控細胞功能[21]。相關研究表明NF-κB作為機體重要的炎癥轉錄因子，與葡萄糖攝取紊亂及胰島素抵抗密切相關，其表達水平在糖尿病前期即開始升高[22]。本研究通過NF-κBp65和IκBα基因表達水平來反映NF-κB信號通路的激活狀況。本研究中實驗G組較M組NF-κBp65蛋白表達水平下降顯著，G組為低劑量黃芪+高劑量茵陳蒿+低劑量荷葉，說明此配伍可能會抑制NF-κB信號通路進而減輕炎癥反應，與正交實驗結果一致。

5 結論

黃芪、茵陳蒿和荷葉三藥存在交互作用，按影響主次順序為黃芪＞茵陳蒿＞荷葉，最佳配伍為半量黃芪、2倍量茵陳蒿和半量荷葉。此配伍組方可改善IGT大鼠胰島素抵抗，通過抑制NF-κB信號通路、減輕炎癥反應，從而控制或延緩IGT向T2DM演變。