戎 萍，閆 融，馬茗晗，張喜蓮，馬 融

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，天津 300193）

近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)不僅是癲癇誘導(dǎo)的結(jié)果，還是引起癲癇發(fā)生、發(fā)展的最重要機(jī)制[1]，且炎性因子可提高P糖蛋白（P-gp）多藥耐藥的表達(dá)，從而阻斷抗癲癇西藥進(jìn)入腦內(nèi)，不能發(fā)揮抗癇作用。中藥復(fù)方疏風(fēng)止痙方是由導(dǎo)師馬融教授根據(jù)“疏風(fēng)解表、開通經(jīng)絡(luò)”的治療原則，由銀翹散化裁而來。銀翹散本為治療風(fēng)熱外感的有效方劑，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的作用[2]，西醫(yī)學(xué)認(rèn)為具有抗炎的作用[3]，且有研究表明以疏風(fēng)為主的銀翹散可降低炎癥信號通路NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)[4]，并可調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號通路上下游細(xì)胞因子的水平[5-6]，降低P-gp的表達(dá)，從而提高腦脊液中卡馬西平的濃度，來達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥性癲癇的目的。本實(shí)驗(yàn)擬從研究疏風(fēng)止痙方對耐藥性癲癇大鼠海馬NF-κB、P-gp的表達(dá)及腦脊液中卡馬西平濃度的影響，觀察疏風(fēng)止痙方是否可以提高腦內(nèi)抗癇藥物的濃度，為臨床中藥復(fù)方添加治療耐藥性癲癇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠100只，體質(zhì)量（80±5）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 氯化鋰（批號為115K1308，100 g/瓶，美國Sigma公司）；阿托品（批號為國藥準(zhǔn)字 H12020382，0.5 mg/mL×10 支/盒，天津金耀藥業(yè)有限公司）；鹽酸匹羅卡品（批號為S31556，100 mg/瓶，美國Sigma公司）；地西泮注射液（批號為國藥準(zhǔn)字0804032，每2 mL含10 mg，天津金耀氨基酸有限公司）；卡馬西平（批號為國藥準(zhǔn)字H11022279，200 mg/片，北京諾華制藥公司）；丙戊酸鈉口服液（批號為國藥準(zhǔn)字 H20041435，300 mL，12 g/瓶，賽諾菲制藥有限公司）；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC，批號為 S30342，25 g/瓶，美國 Sigma公司）；疏風(fēng)止痙方飲片（由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 點(diǎn)燃癲癇大鼠模型 100只大鼠隨機(jī)選取10只作為正常對照組。其余90只采用氯化鋰-匹羅卡品點(diǎn)燃癲癇發(fā)作。采用Racine6級評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0級：無反應(yīng)；Ⅰ級：耳、面部肌肉抽搐；Ⅱ級：肌陣攣，但無直立位；Ⅲ級：肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級：全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作；Ⅴ級：全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作，并失去體位控制。癇性發(fā)作達(dá)到Ⅳ級及以上，解除癇性發(fā)作后存活狀態(tài)良好的大鼠為合格癲癇模型大鼠。在點(diǎn)燃過程中大鼠死亡8只，未達(dá)到級別9只，剩余73只進(jìn)行耐藥癲癇模型的建立。

2.2 建立耐藥性癲癇大鼠模型 將存活良好的癲癇模型大鼠先經(jīng)過14 d丙戊酸鈉預(yù)處理，篩選出每周發(fā)作次數(shù)大于10次的大鼠，作為耐丙戊酸鈉癲癇大鼠。再將耐丙戊酸鈉癲癇大鼠經(jīng)過14 d卡馬西平預(yù)處理，篩選出每周發(fā)作次數(shù)大于10次的癲癇大鼠，將耐丙戊酸鈉及卡馬西平癲癇大鼠作為耐藥性癲癇大鼠模型。在建立耐藥癲癇模型過程中，有11只大鼠因解痙無效死亡，12只每周發(fā)作次數(shù)少于10次，成功篩選的耐藥癲癇模型50只。

2.3 分組及給藥 將未造模的正常大鼠與篩選出的50只耐藥癲癇模型大鼠分為6組：1）正常對照組：生理鹽水按10 mL/kg/次，灌胃，每天2次。2）耐藥模型組：卡馬西平按15 mg/kg/次，灌胃，每天2次。3）陽性對照組：先后予NF-κB特異性抑制吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC）75 mg/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。4）疏風(fēng)止痙方低劑量組：先后予低劑量疏風(fēng)止痙方按生藥含量2 g/mL配置成溶液10 mL/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。5）疏風(fēng)止痙方中劑量組：先后予中劑量疏風(fēng)止痙方按生藥含量4 g/mL配置成溶液10 mL/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。6）疏風(fēng)止痙方高劑量組：先后予高劑量疏風(fēng)止痙方按生藥含量6 g/mL配置成溶液10 mL/kg/次、卡馬西平15 mg/kg/次，灌胃，兩種藥物間隔30 min，每天2次。各組灌胃均持續(xù)28 d。

2.4 監(jiān)測各組大鼠發(fā)作情況 采用影像監(jiān)控系統(tǒng)對所有實(shí)驗(yàn)大鼠全程監(jiān)控并觀察各組大鼠反復(fù)自發(fā)性發(fā)作（SRS）的情況。

2.5 免疫組化法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp分布 取各組大鼠腦組織甲醛固定、石蠟包埋，切片后進(jìn)行脫蠟、入水清洗，依次滴加第一抗體、第二抗體后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素染色封片。

2.6 蛋白免疫印跡法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp蛋白表達(dá) 提取各組大鼠組織目標(biāo)蛋白樣品，進(jìn)行凝膠、電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、一抗孵育、二抗孵育后進(jìn)行檢測。

2.7 高效液相發(fā)檢測腦脊液卡馬西平濃度 大鼠頭部剃毛清潔，固定于腦立體定位儀：68002，顱骨處于水平位，頭部開小口，暴露顱骨表面。左側(cè)海馬定位坐標(biāo)處，用STRONG90+102顱骨鉆鉆顱打孔，插入探針導(dǎo)管。以人工腦脊液Ⅰ沖洗1小時(shí)后收集樣品，立即轉(zhuǎn)存入-80℃冰箱保存。分別以水-甲醇-乙腈=45:45:10為溶劑，配制濃度為0.250、1.000、3.000、5.000、7.500、10.000 μg/mL 的溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以日本島津高效液相色譜儀按色譜條件對各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦脊液卡馬西平進(jìn)行測定。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布和方差不齊的數(shù)據(jù)組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠癇性自主發(fā)作情況 除正常對照組以外，其他各組大鼠均有癲癇發(fā)作；與耐藥模型組比較，陽性對照組發(fā)作次數(shù)雖然有所減少，但兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與疏風(fēng)止痙方各劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；隨著中藥劑量的增加，發(fā)作次數(shù)呈遞減趨勢，且各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見表1。

表1 疏風(fēng)止痙方對耐藥性癲癇大鼠SRS的影響（）Tab.1 Effect of Shufeng Zhijing Prescription on SRS in rats with drug resistant epilepsy（）

表1 疏風(fēng)止痙方對耐藥性癲癇大鼠SRS的影響（）Tab.1 Effect of Shufeng Zhijing Prescription on SRS in rats with drug resistant epilepsy（）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與耐藥模型組比較，□P<0.05；與陽性對照組比較，△P<0.05；與疏風(fēng)止痙方低劑量組比較，#P<0.05；與疏風(fēng)止痙方中劑量組比較，▲P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) SRS發(fā)作次數(shù)正常對照組 10 0耐藥模型組 10 17.3±2.75*陽性對照組 10 15.4±2.67*疏風(fēng)止痙方低劑量組 10 12.2±2.25*□△疏風(fēng)止痙方中劑量組 10 9.2±2.53*□△#疏風(fēng)止痙方高劑量組 10 6.4±2.41*□△#▲

3.2 免疫組化法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp分布 免疫組化評分以5個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)即IHS為評分標(biāo)準(zhǔn)：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級，其中，0%=0、1～10%=1、11～50%=2、51～80%=3、81～100%=4；B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級，其中，無著色為0，淡黃色為 1，棕黃色為 2，棕褐色為 3；則 IHS=A×B，將染色結(jié)果分為 4級：0～2為陰性表達(dá)（-）；IHS≥3為陽性表達(dá)：3～4為弱陽性（+），6～8為陽性（++），9～12為強(qiáng)陽性（+++）。

3.2.1 NF-κBp65的分布表達(dá) 各組NF-κB陽性細(xì)胞的表達(dá)分為4級（陰性-、弱陽性+、陽性++、強(qiáng)陽性+++），均未出現(xiàn)強(qiáng)陽性；各組間比較存在顯著性差異（P＜0．05），組間兩兩比較，耐藥模型組（2例+、4例++）及疏風(fēng)止痙方低劑量組（1例-、1例+、4例++）與正常對照組（4例-，2例+）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；疏風(fēng)止痙方高劑量組陽性表達(dá)例數(shù)（1例-、3例+、2例++）低于疏風(fēng)止痙方低劑量組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見圖 1。

圖1 各組NF-κB陽性表達(dá)情況Fig.1 NF-κB positive expression in each group

3.2.2 P-gp分布表達(dá) 各組P-gp分布表達(dá)分為4 級（陰性-、弱陽性+、陽性++、強(qiáng)陽性+++），正常對照組（3例-、3例+）與疏風(fēng)止痙方高劑量組（1例-、2 例+、3 例++）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；疏風(fēng)止痙方高劑量組表達(dá)水平低于耐藥模型組、疏風(fēng)止痙方低劑量組、疏風(fēng)止痙方中劑量組（均為2例+、4例++），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見圖 2。

圖2 各組P-gp的表達(dá)情況Tig.2 Expression of P-gp in each group

3.3 Western blot法檢測海馬NF-κBp65及腦組織P-gp蛋白表達(dá)

3.3.1 海馬NF-κBp65蛋白表達(dá) 與耐藥模型組相比，陽性對照組NF-κB p65蛋白表達(dá)稍低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；中藥各劑量組蛋白表達(dá)均低于耐藥模型組及陽性對照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），隨著中藥劑量的增加，NF-κB p65 蛋白表達(dá)量呈遞減趨勢，且疏風(fēng)止痙方高劑量組、疏風(fēng)止痙方中劑量組與疏風(fēng)止痙方低劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。見圖 3、表 2。

圖3 各組NF-κBp65、P-gp蛋白定量灰度圖Tig.3 Quantitative grayscale map of NF-κBp65 and P-gp proteins in each group

表2 各組NF-κB p65及P-gp蛋白表達(dá)（）Tab.2 Expression of NF-κB p65 and P-gp proteins in each group（）

表2 各組NF-κB p65及P-gp蛋白表達(dá)（）Tab.2 Expression of NF-κB p65 and P-gp proteins in each group（）

注：與正常對照組比較，*P＜0．05；與耐藥模型組比較，#P＜0．05；與陽性對照組比較，△P＜0．05；與疏風(fēng)止痙方低劑量組比較，□P＜0．05；與疏風(fēng)止痙方中劑量組比較，▲P＜0．05。

分組 動(dòng)物數(shù) NF-κBp65 P-gp正常對照組 6 0．51±0．53 0．13±0．05耐藥模型組 6 1．08±0．04* 0．62±0．06*陽性對照組 6 1．05±0．2* 0．53±0．08*#疏風(fēng)止痙方低劑量組 6 0．84±0．07*#△ 0．52±0．04*#疏風(fēng)止痙方中劑量組 6 0．8±0．09*#△ 0．45±0．06*#疏風(fēng)止痙方高劑量組 6 0．66±0．09*#△□▲ 0．43±0．11*#△□

3.3.2 腦組織P-gp蛋白表達(dá) 與耐藥組比較，其他各組P-gp蛋白表達(dá)均有所下降，且有顯著性差異（P＜0．05）；與對照組比較，疏風(fēng)止痙方各劑量組蛋白表達(dá)量均有所下降，但只與疏風(fēng)止痙方高劑量組有顯著性差異（P＜0．05）；疏風(fēng)止痙方各劑量組隨著中藥劑量增加蛋白表達(dá)量呈遞減趨勢，且疏風(fēng)止痙方高劑量組與疏風(fēng)止痙方低劑量組有顯著差異（P<0．05）。見圖 3、表 2。

3.4 高效液相法檢測腦脊液卡馬西平濃度 除正常對照組，與耐藥模型組比較，各組腦脊液卡馬西平濃度均升高，但只與陽性對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）；與陽性對照組比較，疏風(fēng)止痙方各劑量組腦脊液卡馬西平濃度均降低，與疏風(fēng)止痙方低劑量組、疏風(fēng)止痙方中劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；疏風(fēng)止痙方各劑量組隨著中藥劑量的增加，腦脊液中卡馬西平濃度呈遞增趨勢，疏風(fēng)止痙方中劑量組比疏風(fēng)止痙方低劑量組平均升高15．38%，疏風(fēng)止痙方高劑量組比疏風(fēng)止痙方中劑量組平均升高20%，3 組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），見表 3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦脊液中卡馬西平濃度（）Tab.3 Level of carbamazepine in cerebrospinal fluid of each group（） μg/mL

表3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦脊液中卡馬西平濃度（）Tab.3 Level of carbamazepine in cerebrospinal fluid of each group（） μg/mL

分組 動(dòng)物數(shù) 濃度耐藥模型組 4 0．64±0．13陽性對照組 4 1．06±0．20疏風(fēng)止痙方低劑量組 4 0．65±0．15疏風(fēng)止痙方中劑量組 4 0．75±0．24疏風(fēng)止痙方高劑量組 4 0．90±0．23

4 討論

癲癇是兒科常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。經(jīng)過正規(guī)中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合治療有70%～80%的癲癇可得到有效控制，但仍有30%左右成為耐藥性癲癇[7]。癲癇患者治療不夠及時(shí)使病程拖延長久是引起癲癇耐藥的危險(xiǎn)因素[8-9]，并且有研究[10-11]報(bào)道，癲癇患者首次治療前發(fā)作頻繁也是造成癲癇耐藥的重要因素。臨床研究發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇的特征表現(xiàn)是，如果患者對一種抗癲癇藥物耐受，往往也對其他抗癲癇藥物不敏感，即使這些藥物的作用機(jī)制、分子結(jié)構(gòu)不同[12]。耐藥性癲癇的形成嚴(yán)重影響患兒認(rèn)知功能，降低生活質(zhì)量。近年來，有大量研究發(fā)現(xiàn)癲癇動(dòng)物模型和癲癇患者腦組織中及外周血中均有顯著的炎性反應(yīng)現(xiàn)象，白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等以細(xì)胞因子為主的炎性介質(zhì)顯著異常表達(dá)[13-14]。而炎性細(xì)胞因子和神經(jīng)系統(tǒng)興奮活性遞質(zhì)可激活NF-κB，通過促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)可進(jìn)一步促使炎性細(xì)胞因子合成與釋放。長時(shí)期TNF-α的刺激可使多藥耐藥P糖蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能被激活[15]。近年來研究報(bào)道證實(shí)大部分AEDs是P-gp的底物[16]，在病理情況下，過度表達(dá)的P-gp與抗癲癇藥物結(jié)合，將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵入血液中，使藥物無法發(fā)揮藥效，從而產(chǎn)生耐藥機(jī)制。

疏風(fēng)止痙方由馬融教授根據(jù)銀翹散化裁而來。中醫(yī)認(rèn)為，難治性癲癇病程日久，痰、熱、瘀等病理因素長期伏留，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)癲癇反復(fù)發(fā)作引發(fā)炎癥反應(yīng)。由銀翹散化裁而來的疏風(fēng)止痙方主要由：金銀花、連翹、荊芥穗、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、淡竹葉、薄荷、蘆根、甘草、金果欖、全蝎組成。銀翹散原方具有疏風(fēng)解表、開通經(jīng)絡(luò)的功效，不但使邪有出路，還能助藥直達(dá)病所，此外方中加入金果欖清熱利咽，并以全蝎加強(qiáng)通絡(luò)止痙之功。全方共奏疏風(fēng)止痙、清熱通絡(luò)之功效。正如《幼幼集成》云：“凡小兒諸般癇證，先服消風(fēng)丸七服。此非治癇之藥，用以疏散外感，開通經(jīng)絡(luò)，庶后藥得以流通故而。”現(xiàn)代藥理研究顯示，金銀花、連翹的有效成分有較強(qiáng)的抗炎作用，且金銀花可以顯著抑制NF-κB的激活及從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位并抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性[17-18]。全蝎抗癲癇的機(jī)制可能是全蝎醇提物可以減少大鼠海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白mRNA的表達(dá)[19]。

前期臨床研究觀察發(fā)現(xiàn)由銀翹散化裁而來的疏風(fēng)止痙方可有效控制難治性癲癇的發(fā)作[20-22]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：1）疏風(fēng)止痙方聯(lián)合卡馬西平可有效控制癲癇發(fā)作次數(shù)，且表明隨著疏風(fēng)止痙方劑量的增加，發(fā)作次數(shù)顯著減少（有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。這提示在臨床中治療耐藥性癲癇時(shí)可在一定范圍內(nèi)增加中藥復(fù)方的劑量來控制癲癇的發(fā)作。2）疏風(fēng)止痙方聯(lián)合卡馬西平治療耐藥性癲癇大鼠隨著中藥劑量的增加，腦脊液中卡馬西平濃度呈遞增趨勢（無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），疏風(fēng)止痙方中劑量組比中低組平均升高15．38%，疏風(fēng)止痙方高劑量組比疏風(fēng)止痙方中劑量組平均升高20%。綜上所述，中藥復(fù)方聯(lián)合抗癇藥物可提高腦內(nèi)抗癇藥物濃度，減少癲癇發(fā)作次數(shù)。