王俊強(qiáng)，孔祥珍，華欲飛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

鈣是維持人類生命健康重要的礦物質(zhì)之一，其約占成年人體重的2%，缺鈣會增加人體骨折和患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)，隨著全球人口老齡化現(xiàn)象的加劇，研究新型鈣補(bǔ)充劑，以增加人體對鈣的吸收利用率越來越受到人們的關(guān)注[1]。另外，鈣還具有參與細(xì)胞內(nèi)代謝、凝血、神經(jīng)傳導(dǎo)、骨骼生長等重要功能[2]。

大豆蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[3]，具有降血脂、降膽固醇和預(yù)防骨質(zhì)疏松、更年期綜合征等生理功能[4-5]。大豆蛋白的水解產(chǎn)物可以良好地保留大豆蛋白中的氨基酸，同時(shí)，大豆蛋白被水解成小分子的多肽后，更容易被人體吸收利用[6]。另外，有研究認(rèn)為大豆肽可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)具有促進(jìn)腦功能的作用[7]。Bao等[8]的研究表明，大豆蛋白水解產(chǎn)物具有鈣螯合能力，可以作為鈣補(bǔ)充劑的生產(chǎn)原料。呂瑩等[9]通過Caco-2實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大豆肽鈣螯合物對促進(jìn)腸道細(xì)胞對鈣的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程起到了重要的作用。

本文研究了大豆肽具有螯合能力的相對分子質(zhì)量分布，結(jié)合氨基酸分析說明了具有鈣螯合能力的大豆肽的特征，研究了大豆肽鈣螯合物在磷酸鹽緩沖液中的鈣保留率和不同pH條件下的穩(wěn)定性。同時(shí)通過Zeta電位分析和XRD研究大豆肽鈣螯合物的作用類型。最后，通過DSC和TGA對比大豆肽及大豆肽鈣螯合物的熱穩(wěn)定性。以期為大豆肽鈣螯合物的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

低溫脫脂豆粕，山東禹王集團(tuán)；堿性蛋白酶，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。氫氧化鈉、鹽酸、無水氯化鈣、無水乙醇、硝酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純；乙腈，HPLC。

K9840自動凱氏定氮儀，Himac CR21 GⅡ型冷凍離心機(jī)，恒溫干燥箱，AA-240原子吸收分光光度計(jì)(火焰型)，D-2000 Elite 高效液相色譜儀，835-50 型氨基酸自動分析儀，Nano Brook Omni 型多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，尼魯噴霧干燥機(jī)，制備級高效液相色譜儀，X射線衍射儀，DSC3型差示掃描量熱儀，TGA2型熱重分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆肽的制備

將低溫脫脂豆粕粉碎后，按料液比1∶5加85%乙醇醇洗60 min，42℃干燥后，按料液比1∶9加入去離子水，于pH 4.5條件下酸沉1 h，8 500 r/min離心30 min，沉淀加入9倍體積的去離子水充分分散，于pH 9.0、60℃條件下加入2%的堿性蛋白酶水解4 h，調(diào)pH至中性滅酶，8 500 r/min離心30 min，上清噴霧干燥，即得大豆肽。

1.2.2 大豆肽鈣螯合物的制備

配制100 mL 4%的大豆肽溶液，調(diào)節(jié)pH至7.8，加入4 mL 2 mmol/L的CaCl2溶液，于40℃恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)1 h，4 000 r/min離心10 min，上清中加入8倍體積無水乙醇，靜置30 min，離心，加入85%乙醇洗兩次，每次醇洗時(shí)間為30 min，離心后沉淀于42℃烘干，即得大豆肽鈣螯合物。

1.2.3 大豆肽鈣螯合物在磷酸鹽溶液中的穩(wěn)定性

向pH 8.0的磷酸鹽(10～200 mmol/L)緩沖液(PBS)中添加大豆肽鈣螯合物，使溶液中鈣含量為1 mg/mL，于37℃下振蕩水浴30 min，離心后，測定上清中鈣含量，計(jì)算鈣保留率，同時(shí)，向溶液中添加相同含量的CaCl2作對照。鈣保留率按下式計(jì)算。

鈣保留率=離心后上清中鈣含量/溶液中鈣含量×100%

1.2.4 氨基酸組成的測定

采用OPA FMOC柱前衍生，通過氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定。稱取約0.1 g大豆肽或大豆肽鈣螯合物于水解管內(nèi)，加入8 mL 6 mol/L的HCl溶液，混勻后放于110℃的烘箱內(nèi)消解22 h。取出冷卻，將消解液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，用4.8 mL 10 mol/L氫氧化鈉溶液中和，并用水定容至刻度。采用雙層濾紙過濾，取1 mL濾液離心(10 000 r/min，10 min)，取上清液進(jìn)行測定。

1.2.5 大豆肽鈣螯合物的脫鈣

稱取25 mg大豆肽鈣螯合物，加入5 mL 0.2 mol/L的pH 8.0 PBS中，于旋渦振蕩器上振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min，上清液為脫鈣后的大豆肽鈣螯合物。該方法可脫除大豆肽鈣螯合物中99%以上的鈣，且大豆肽無損失。

1.2.6 大豆肽鈣螯合物在不同pH條件下的穩(wěn)定性

將一定量的大豆肽鈣螯合物溶解于去離子水中，使溶液中鈣含量為1 mg/mL，分別調(diào)pH至2.0～8.0，于37℃下振蕩水浴2 h，離心(10 000 r/min，10 min)，測定上清的相對分子質(zhì)量。

1.2.7Zeta電位分析

參考劉成梅等[10]的方法并加以改進(jìn)。將大豆肽或大豆肽鈣螯合物配制成0.1%的溶液，調(diào)節(jié)pH至7.8，進(jìn)行Zeta電位的測定。

1.2.8 XRD分析

分別將大豆肽、氯化鈣、大豆肽鈣螯合物制成粉末，進(jìn)行XRD分析，掃描角度5°～90°。

1.2.9 DSC分析

分別稱取3 mg左右的大豆肽及大豆肽鈣螯合物于坩堝內(nèi)，置于差示掃描量熱儀中，進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，同時(shí)進(jìn)行空白對照。溫度范圍25～200℃，升溫速度10℃/min，N2流速50 mL/min。

1.2.10 TGA分析

分別稱取大豆肽及大豆肽鈣螯合物3 mg于坩堝中，將坩堝置于熱重分析儀中，測定溫度25～900℃，升溫速度10℃/min，N2流速30 mL/min，記錄樣品質(zhì)量，計(jì)算并繪制質(zhì)量損失率曲線。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過IBM SPSS Statistics 25和Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性蛋白酶水解大豆肽的水解度和鈣結(jié)合量

低溫脫脂豆粕經(jīng)醇洗酸沉后用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，水解4 h過程中的水解度隨時(shí)間的變化見圖1。

圖1 豆粕水解度隨時(shí)間變化趨勢

由圖1可知，豆粕在pH 9.0條件下水解，其在最初0.5 h迅速水解，之后水解速度逐漸降低，經(jīng)過4 h，水解度可達(dá)19.84%。對經(jīng)此工藝水解獲得的大豆肽進(jìn)行鈣螯合力的測定，得到其鈣結(jié)合量為53.03 mg/g。

2.2 大豆肽鈣螯合物在磷酸鹽溶液中的穩(wěn)定性

人體攝入的磷元素主要以無機(jī)鹽形式在腸道被吸收，濃度約為20 mmol/L[11]。為了模擬大豆肽鈣螯合物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性，并為后續(xù)分析大豆肽鈣螯合物的性質(zhì)提供依據(jù)，研究了大豆肽鈣螯合物在不同濃度的PBS溶液中的鈣保留率。結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，與無機(jī)鈣相比，大豆肽鈣螯合物在低濃度的PBS中具有更高的鈣保留率，在10 mmol/L的PBS中，鈣保留率可達(dá)74.5%，當(dāng)PBS為20 mmol/L時(shí)，大豆肽鈣螯合物的鈣保留率仍有62.17%，表明大豆肽鈣螯合物在低濃度的PBS中具有更好的穩(wěn)定性。當(dāng)PBS的濃度為40～120 mmol/L時(shí)，大豆肽鈣螯合物的鈣保留率穩(wěn)定在50%左右，當(dāng)繼續(xù)增加PBS濃度時(shí)，鈣保留率迅速下降，當(dāng)PBS濃度為200 mmol/L時(shí)，鈣保留率低于1%。這表明大豆肽與鈣離子在結(jié)合過程中，可能存在低親和性位點(diǎn)和高親和性位點(diǎn)兩類結(jié)合位點(diǎn)，這一結(jié)果與張曉維[12]的報(bào)道相一致。

圖2 大豆肽鈣螯合物與CaCl2在不同濃度磷酸鹽緩沖液中的鈣保留率

2.3 氨基酸組成

為了研究大豆肽中氨基酸組成對大豆肽與鈣離子反應(yīng)的影響，測定了大豆肽及大豆肽鈣螯合物的氨基酸組成，結(jié)果見表1。

表1 大豆肽和大豆肽鈣螯合物的氨基酸組成及含量 %

由表1可知，大豆肽與鈣反應(yīng)后，谷氨酸含量由21.70%增加到35.69%，天冬氨酸含量從12.63%增加到14.14%，這兩種氨基酸的含量大幅增加，可能是由于谷氨酸和天冬氨酸均屬于酸性氨基酸，其側(cè)鏈基團(tuán)均含有—COOH，能夠提供鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，因此在螯合反應(yīng)過程中有重要作用。這一結(jié)果與王小林[13]、崔宇[14]等的研究相一致。

2.4 相對分子質(zhì)量分布

分別測定了大豆肽、大豆肽鈣螯合物及大豆肽鈣螯合物經(jīng)0.2 mol/L的PBS脫鈣后的螯合肽的相對分子質(zhì)量，結(jié)果見表2。

表2 大豆肽、大豆肽鈣螯合物和螯合肽的相對分子質(zhì)量分布 %

由表2可知，77.85%的大豆肽相對分子質(zhì)量小于1 kDa，超過50%的大豆肽相對分子質(zhì)量小于0.5 kDa。與大豆肽相比，81.81%的螯合肽相對分子質(zhì)量小于1 kDa，有顯著提高。而相對分子質(zhì)量在1～3 kDa的螯合肽占比減少，處于3～5 kDa的螯合肽則有所增加，表明與鈣離子螯合能力較強(qiáng)的大豆肽相對分子質(zhì)量主要集中在小于1 kDa。與螯合肽相比，大豆肽鈣螯合物的相對分子質(zhì)量則明顯向高相對分子質(zhì)量范圍遷移，如相對分子質(zhì)量處于5～10 kDa的占比提高了11.07個(gè)百分點(diǎn)，處于3～5 kDa的占比提高了6.28個(gè)百分點(diǎn)，處于1～3 kDa的占比提高了13.75個(gè)百分點(diǎn)，而小于1 kDa的相對分子質(zhì)量占比有明顯的下降，表明大豆肽鈣螯合物具有更高的相對分子質(zhì)量。

2.5 大豆肽鈣螯合物在不同pH條件下的穩(wěn)定性

螯合肽與大豆肽鈣螯合物的相對分子質(zhì)量分布存在明顯的差異，通過表征不同pH條件下的相對分子質(zhì)量分布可以說明大豆肽鈣螯合物在不同pH條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH條件處理后大豆肽鈣螯合物的相對分子質(zhì)量分布圖

從圖3可以看出，大豆肽鈣螯合物在各pH條件下的相對分子質(zhì)量分布沒有明顯差異，且與所制備的大豆肽鈣螯合物的相對分子質(zhì)量分布情況較為一致，表明大豆肽鈣螯合物在各pH條件下均有良好的穩(wěn)定性，不同pH條件下均沒有發(fā)生較大程度的解離。

2.6 Zeta電位

目前的研究認(rèn)為鈣離子與多肽的結(jié)合位點(diǎn)主要是游離氨基和游離羧基，在反應(yīng)過程中可能導(dǎo)致表面電荷性質(zhì)的改變，因此通過Zeta電位分析可以反映鈣離子與大豆肽作用的情況。Zeta電位結(jié)果顯示，大豆肽平均電位為-37.73 mV，在與鈣離子結(jié)合后，電負(fù)值顯著下降至-12.32 mV，表明大豆肽與鈣離子結(jié)合的過程中大豆肽表面所帶電荷明顯減少，說明大豆肽與鈣離子形成了新的化合物。

2.7 XRD分析

分別對大豆肽、氯化鈣及大豆肽鈣螯合物進(jìn)行XRD分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 CaCl2、大豆肽及大豆肽鈣螯合物的XRD圖譜

從圖4可以看出，CaCl2在XRD圖譜中有明顯的特征衍射峰，而大豆肽僅在20°時(shí)有1個(gè)較寬的衍射峰。在大豆肽與CaCl2反應(yīng)后，CaCl2的特征衍射峰消失，同時(shí)，大豆肽鈣螯合物在20°的衍射峰強(qiáng)度有所下降，峰寬收窄，且衍射峰向右偏移至22.5°，同時(shí)在42.5°處出現(xiàn)1個(gè)微弱的衍射峰，表明大豆肽與鈣離子發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，形成了新的化合物。

2.8 DSC分析(見圖5)

圖5 大豆肽及大豆肽鈣螯合物的DSC分析

從圖5可以看出，大豆肽在136.60℃處有1個(gè)吸熱峰，該吸熱峰為大豆肽的化學(xué)鍵斷裂導(dǎo)致的，鍵能為223.51 J/g，在鈣離子與大豆肽發(fā)生螯合反應(yīng)后，該吸熱峰向右偏移至159.58℃，鍵能為149.81 J/g，吸熱峰值的升高表明大豆肽鈣螯合物具有更好的熱穩(wěn)定性，而鍵能的降低是由于大豆肽的化學(xué)鍵受到了鈣的影響。

2.9 TGA分析(見圖6)

圖6 大豆肽及大豆肽鈣螯合物的TGA曲線

從圖6可以看出，大豆肽及大豆肽鈣螯合物都出現(xiàn)了3個(gè)失重區(qū)，溫度范圍分別位于50～120℃、120～350℃、350～900℃。王飛鏑[15]研究認(rèn)為在50～120℃范圍內(nèi)的失重對應(yīng)的主要為可凍結(jié)水(自由水和束縛水)，這部分水位于肽鏈外側(cè)，最容易失去。而處于120～350℃范圍內(nèi)的失重主要是氫鍵以及肽鏈上不同位置的化學(xué)鍵的斷裂[16]，在這一失重區(qū)，大豆肽失重率約為40%，而大豆肽鈣螯合物的失重率約為30%，大豆肽的失重率高于大豆肽鈣螯合物的失重率，同時(shí)，在這一區(qū)間，大豆肽鈣螯合物的失重溫度高于大豆肽的失重溫度。表明大豆肽鈣螯合物相較于大豆肽具有更好的熱穩(wěn)定性，這一結(jié)果也與DSC的結(jié)果相一致。當(dāng)溫度超過350℃時(shí)，大豆肽及大豆肽鈣螯合物的失重則主要表現(xiàn)為灰化的過程。

3 結(jié) 論

大豆肽在水解4 h條件下，水解度可達(dá)19.84%，大豆肽與鈣離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，鈣結(jié)合量為53.03 mg/g，且制備的大豆肽鈣螯合物在低濃度磷酸鹽存在時(shí)仍具有良好的穩(wěn)定性，在磷酸鹽緩沖液濃度為10 mmol/L時(shí)，鈣保留率為74.5%，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中鈣保留率為62.17%。具有較高螯合能力的大豆肽的相對分子質(zhì)量主要集中在小于1 kDa的范圍內(nèi)。谷氨酸和天冬氨酸是參與大豆肽鈣螯合反應(yīng)重要的氨基酸。大豆肽鈣螯合物在各pH條件下均沒有發(fā)生明顯的解離現(xiàn)象，表明其在不同pH條件下均具有較好的穩(wěn)定性。Zeta電位分析表明，大豆肽與鈣離子發(fā)生反應(yīng)后，其表面的電負(fù)性有顯著的下降。大豆肽鈣螯合物在XRD圖譜中的衍射峰有所收窄，且氯化鈣的特征峰消失，表明大豆肽與鈣離子形成了新的化合物。對大豆肽及大豆肽鈣螯合物的DSC分析和TGA分析表明，大豆肽與鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)后，生成的大豆肽鈣螯合物具有比大豆肽更好的熱穩(wěn)定性。