朱會(huì)霞 孫金旭 李瑩瑩 李雪珍

（衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

桑黃是一種生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的貴重藥用菌。經(jīng)研究可知桑黃主要成分是多糖，其次還有甾醇類、黃酮和三萜類等多種成分，具有抗癌、增強(qiáng)人體免疫力、降低血糖等功能。桑黃是抗癌功效排在前列的藥用菌，現(xiàn)已作為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥行業(yè)研究的熱點(diǎn)，被相關(guān)各界廣泛關(guān)注和研究。

本文探討了α-萘乙酸、油酸、L-谷氨酸對(duì)促進(jìn)桑黃菌絲生長(zhǎng)及多糖產(chǎn)量的作用，為優(yōu)化桑黃真菌培養(yǎng)條件提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 桑黃菌種。保藏于衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂 20，MgSO4·7H2O 1.5，VB10.01，KH2PO43.0，20%的土豆汁配制，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，黃豆粉10，酵母膏 1，MgSO4·7H2O 0.5，VB10.0l，KH2PO41.0，pH6.0蒸餾水配制，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖36，蛋白胨4，pH值6.0， 酵 母 膏 2 g， MgSO4·7H2O 0.5， VB10.05，KH2PO41.0，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法。斜面種子活化：取出保藏在4℃下的斜面菌體于28℃的培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)3 d。

液體種子培養(yǎng)：在裝有150 ml種子培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中轉(zhuǎn)入1 cm2帶培養(yǎng)基的活化好的斜面菌體(該過程在無菌室中操作)，50 r/min培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)時(shí)保持溫度在28℃。

發(fā)酵培養(yǎng)：在裝有150 ml培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中接入10%已培養(yǎng)好的液體種子，150 r/min下振蕩培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)時(shí)溫度保持在28℃。

NAA添加培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)前在培養(yǎng)基中加入不同濃度的生長(zhǎng)因子NAA，滅菌后如上所示培養(yǎng)。

油酸添加培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)前于培養(yǎng)基中加入不同濃度的生長(zhǎng)因子油酸，滅菌后如上所示培養(yǎng)。

L-谷氨酸添加培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)前于培養(yǎng)基中加入不同濃度的生長(zhǎng)因子L-谷氨酸，滅菌后如上所示培養(yǎng)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 培養(yǎng)液中菌絲含量的測(cè)定。烘干稱重法：取適量的發(fā)酵液，用濾紙(已烘干并稱重)過濾，再用水緩慢沖洗至洗液無色透明。在60℃的烘箱中烘至恒重，于干燥器中冷卻至常溫，稱重。

1.4.2 桑黃胞外多糖含量的測(cè)定。苯酚—硫酸法：首先制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，用移液槍吸取稀釋的樣品溶液1 ml，加1 ml蒸餾水，然后加入5%的苯酚溶液1 ml，再加入濃硫酸5 ml，振蕩均勻。室溫下靜止20 min，測(cè)定490 nm處的吸光度值，再根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線便可計(jì)算胞外多糖含量(胞外多糖含量=所測(cè)得多糖含量-培養(yǎng)液中葡萄糖含量)。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-萘乙酸(NAA)對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及胞外多糖產(chǎn)量的影響。NAA是一種可作用于部分蕈菌的菌絲、加快其生長(zhǎng)的刺激素。發(fā)酵培養(yǎng)開始前在培養(yǎng)基中分別加入 0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L的NAA，滅菌后進(jìn)行培養(yǎng)。完成培養(yǎng)后測(cè)桑黃菌體以及多糖的生成量，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，嚴(yán)控生長(zhǎng)因子NAA的添加量，對(duì)穩(wěn)定發(fā)酵培養(yǎng)過程、增加桑黃菌絲體和多糖的生成量具有重要作用。增加NAA濃度，菌絲體及多糖產(chǎn)量也隨之逐步遞增，但當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.2 mg/L時(shí)，菌絲體和多糖的增重達(dá)到最大，此時(shí)菌絲體增重30.96%，多糖增重28%。再繼續(xù)增加NAA濃度，菌絲體及多糖生成量呈下降趨勢(shì)，此時(shí)NAA對(duì)菌絲體及多糖生成起抑制作用。因此，NAA促進(jìn)桑黃菌絲體和多糖生成的最適宜濃度為0.2 mg/L。

圖1 N A A對(duì)桑黃真菌菌絲干重及多糖產(chǎn)量的影響

2.2 油酸對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及胞外多糖產(chǎn)量的影響。一部分植物油可以作用在真菌的細(xì)胞壁，通過改變其透性進(jìn)而促進(jìn)其胞外多糖的產(chǎn)生。發(fā)酵培養(yǎng)開始前在培養(yǎng)基中分別加入0g/L、1g/L、2g/L、3 g/L、4 g/L的油酸，滅菌后進(jìn)行培養(yǎng)。完成培養(yǎng)后測(cè)桑黃菌體以及多糖的生成量，結(jié)果如圖2。

圖2 油酸對(duì)桑黃真菌菌絲干重及多糖產(chǎn)量的影響

由圖2可知，當(dāng)加入油酸的濃度由1 g/L逐增到4 g/L時(shí)，可以明顯地作用于菌絲體和多糖，促進(jìn)二者產(chǎn)量提高。當(dāng)加入的油酸濃度為1 g/L時(shí)，菌體和多糖的生成量均有顯著提高，且增幅最大，其中菌絲體增重49.3%，多糖增重44%。

2.3 L-谷氨酸對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及胞外多糖產(chǎn)量的影響。L-谷氨酸對(duì)發(fā)生在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝具有積極作用。發(fā)酵培養(yǎng)開始前在培養(yǎng)基中分別加入0 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5g/L、2g/L的L-谷氨酸，滅菌后進(jìn)行培養(yǎng)。完成培養(yǎng)后測(cè)桑黃菌體以及多糖的生成量，結(jié)果如圖3。

圖3 L-谷氨酸對(duì)桑黃真菌菌絲干重及多糖產(chǎn)量的影響

由圖3可知，加入一定量的L-谷氨酸能夠有效促進(jìn)桑黃真菌菌絲體及多糖產(chǎn)量的提高。當(dāng)加入的L-谷氨酸濃度為1 g/L時(shí)，二者的生成量增加幅度最大。此時(shí)，菌絲體增重27.06%，多糖增重26%。當(dāng)加入的L-谷氨酸濃度超過1 g/L時(shí)，L-谷氨酸促進(jìn)菌體及多糖生成量的增幅逐漸降低。因此，L-谷氨酸提升桑黃菌絲體和多糖生成量的最適濃度為1 g/L。

3 結(jié)論

研究的結(jié)果表明，加入生長(zhǎng)因子α-萘乙酸(NAA)、油酸、L-谷氨酸，都對(duì)提升桑黃真菌菌絲體及多糖的生成量有一定作用。當(dāng)所加的α-萘乙酸為0.2 mg/L時(shí)，菌絲體和多糖的生成量達(dá)到最大，此條件下菌絲體增重30.96%，多糖增重28%；加入的油酸為1 g/L時(shí)，菌絲體和多糖的生成量達(dá)到最大，此條件下菌絲體增重49.3%，多糖增重44%；加入的L-谷氨酸為1 g/L時(shí)，菌絲和多糖的生成量達(dá)到最大，此條件下菌絲體增重27.06%，多糖增重26%。