曲志強，林漢亮，許肖楓，馬力克·艾則孜，羅毅，馬站，孫曉林，劉光遠

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046；3.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830011)

蜱隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，蜘蛛綱(Arachnida)，螨亞綱(Acari)，寄螨總目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)，分為3個科：硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)和納蜱科(Nuttalliellidae)，其中主要以硬蜱科為主[1-3].蜱是一類營吸血性外寄生蟲，是僅次于蚊類的世界第2大傳播媒介，可傳播眾多諸如病毒，細菌以及寄生蟲等人和動物的重要疾病[1，4]，對人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了極大危害[4].

斑點熱立克次體是一類人獸共患的自然疫源性疾病，主要傳播媒介為蜱、螨[5]，又稱其為蜱熱或蜱傳斑疹傷寒[6].可以分為3大類群，包括斑疹熱組(spotted fever group，SFGR)、斑疹傷寒組(typhus group，TG)及叢林斑疹傷寒(scrub typhus group，STG)[7]，是一類原核生物型、短小棒狀或球形狀、革蘭染色陰性的專性細胞內(nèi)繁殖的微生物[8]，優(yōu)勢類群為SFGR.我國報道的SFGR有10種，其中在新疆分布的蜱種體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的SFGR有7種，包括埃氏立克次體(R.aeschlimannii)，康氏立克次體(R.conorii)，拉歐蒂立克次體(R.raoultii)，西伯利亞立克次體(Rickettsiasibirica)，斯洛伐克立克次體(R.slovaca)馬賽立克次體(R.massiliae)，和暫定巴布瑞立克次體(CandidatusR.barbariae)[9-10].

新疆占中國國土面積的六分之一，與8個國家接壤擁有5 600 km長的邊界線[11]，是我國5大牧場之一[12].位于東亞和歐洲之間的古絲綢之路上，國際牲畜貿(mào)易頻繁[13]，同時也增加了外來病原的傳播風(fēng)險.試驗選擇不同地域環(huán)境的5地(州)10個縣(市)為調(diào)查區(qū)域，在4～5月份新疆蜱蟲活動高峰期對其進行采集[14]，對蜱傳斑點熱立克次體病原進行檢測，通過流行病學(xué)調(diào)查有助于了解新疆部分地區(qū)SFGR病原的流行情況和現(xiàn)狀，為蜱傳斑點熱立克次體病原的預(yù)防和控制提供一定的數(shù)據(jù)支持.

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(必威安泰 BHC1300)，普通PCR儀(Bio-RAD)，核酸電泳儀(北京六一儀器 DYY-12型)，全自動凝膠成像儀(培潔科技，SKL-4-01-018)恒溫震蕩儀(eppendorf)，4 ℃離心機(Eddendorf centrifuge 5810R)，水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司).

1.3 蜱的采集與鑒定

2018年4～5月新疆蜱種活躍高峰期時，對新疆喀什地區(qū)、克孜勒蘇州、伊犁州、塔城地區(qū)、阿爾泰地區(qū)5個地州的葉城縣、阿圖什市、阿合奇縣、伊寧市、新源縣、尼勒克縣、察縣、鞏留縣、塔城市、吉木乃縣10個邊境縣(市)(圖1)，采用人工布旗法對游離蜱和寄生于家畜體表的蜱進行采集，實驗室利用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法進行種類鑒定[2].

圖1 樣品采集地區(qū)Figure 1 The regional map of sample collection area

1.4 蜱DNA的提取

1.5 引物設(shè)計與目的基因擴增

以SFGR外膜蛋白A基因(ompA)設(shè)計引物并進行PCR擴增.引物序列 ：Rr190.70p 5′-ATG GCGAATATTTCTCCAAAA-3′和Rr190.701n 5′-GTTCCGTTAATGGCAGCATCT-3′.PCR擴增體系為25 μL：預(yù)混酶13 μL，水8 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL.反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min.將PCR擴增陽性結(jié)果進行膠回收，將膠回收產(chǎn)物與T-Easy載體連接，轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞中，加入IPTG(0.1 mol/L)和X-Gal后均勻涂布于LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜.挑取白色菌斑進行搖菌培養(yǎng)，將檢測為陽性的菌液送西安擎科澤西生物科技有限公司測序.

1.6 序列比對及進化分析

將測序結(jié)果整理后上傳至NCBI中進行BLAST，通過比對結(jié)果驗證測序結(jié)果的正確性和所擴增病原屬于那一種病原或與那種病原同源性較高.然后利用MEGA 6.0軟件的NJ(neighbor Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析來自不同地區(qū)和不同種病原的進化關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱蟲的分類與鑒定

對新疆10個邊境縣(市)采集到的游離蜱、飽血或半飽血蜱共2 079只進行分類鑒定，經(jīng)鑒定，采集的蜱蟲共包括3屬7個種，革蜱屬的蜱有森林革蜱(Dermacentorsilvarum)、草原革蜱(D.nuttalli)、脛距革蜱(D.pavlovskyi)；璃眼蜱屬有小亞璃眼蜱(Hyalommaanatolicum)、麻點璃眼蜱(H.rufipes)、亞洲璃眼蜱(H.asiaticum)；扇頭蜱屬為血紅扇頭蜱(Rhipicephalussanguineus).

2.2 SFGR病原基因組的PCR擴增結(jié)果

以SFGR 外膜蛋白基因ompA設(shè)計的引物70p/701n對新疆蜱蟲基因組進行擴增，擴增得到589 bp的基因片段(見圖2)，對擴增結(jié)果經(jīng)測序和序列比對分析，結(jié)果共檢測出6種斑點熱立克次體病原，包括：拉歐蒂立克次體(Rickettsiaraoultii)、西伯利亞立克次體(Rickettsiasibirica)、斯洛伐克立克次體(Rickettsiaslovaca)、埃氏立克次體(Rickettsiaaeschlimannii)和2株未定種(CandidatusRickettsia)，其中一株未定種為暫定巴布瑞立克次體(CandidatusR.barbariae).

對不同地區(qū)的蜱種和病原檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果如表2.1.調(diào)查結(jié)果顯示，陽性率高于50%的地區(qū)有6個縣(市)，占被檢地區(qū)的60%.陽性率超過70%的地區(qū)為阿圖什市、伊寧市和新源縣，平均陽性率也高達51.5%，不同蜱種間的感染率為1.1%～80%.

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：SFGR 病原基因.M：DL2000 Marker；1：SFGR pathogen gene.圖2 SFGR病原基因組PCR擴增結(jié)果Figure 2 The PCR amplification results of SFGR pathogen genome

通過對新疆不同地區(qū)SFGR病原陽性率和不同蜱種的病原陽性率進行統(tǒng)計，結(jié)果陽性率較高的地區(qū)為阿圖什市、伊寧市和新源縣(圖3)；不同蜱種中，亞洲璃眼蜱、小亞璃眼蜱和森林革蜱的陽性檢出率較高(圖4).綜合分析得知，被檢各地的蜱蟲分布種類不同，各自的陽性檢出率也不盡相同，其中拉歐蒂立克次體主要由革蜱攜帶傳播，埃氏立克次體主要是通過璃眼蜱進行感染.因此，存在革蜱和璃眼蜱的地區(qū)這2種病原較為流行.

圖3 不同地區(qū)斑點熱立克次體陽性率統(tǒng)計結(jié)果Figure 3 The statistical results of positive rate of SFGR in different areas

圖4 不同蜱種中斑點熱立克次體陽性率統(tǒng)計結(jié)果Figure 4 The statistical results of positive rate of SFGR among different ticks species

表1 不同蜱種和斑點熱立克次體病原檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.3 系統(tǒng)進化分析與相似性比較

利用MEGA 6.0軟件鄰接法NJ構(gòu)建新疆不同地區(qū)SFGR病原基因組擴增獲得的核酸序列和NCBI下載的斑點熱立克次體的核酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以嗜吞噬細胞無形體作為外群(圖5)，通過對系統(tǒng)進化樹分析得出，伊寧的未定種與暫定巴布瑞立克次體親緣關(guān)系較近，其相似性達到了99.6%，與察縣暫定巴布瑞立克次體的相似性為98.5%(圖6)；所有拉歐蒂立克次體、埃氏立克次體、斯洛伐克立克次體和西伯利亞立克次體病原都能各自分在同一分支，且相似性較高.

圖5 不同地區(qū)斑點熱立克次分子體系統(tǒng)進化樹分析Figure 5 Molecular phylogenetic tree analysis of SFGR in different areas

3 討論與結(jié)論

此次調(diào)查從蜱蟲活動高峰期的4～5月份對新疆10個邊境縣(市)的蜱進行采集，采集地區(qū)與哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦和巴基斯坦相鄰.本次共采集到2 079只蜱，經(jīng)鑒定包括3屬7個蜱種，共檢測出6種斑點熱立克次體病原，其中主要以拉歐蒂立克次體病原最為常見和分布地區(qū)廣泛.拉歐蒂立克次體最早發(fā)現(xiàn)于俄羅斯的草原革蜱(D.nuttalli)和短小扇頭蜱(Rh.pumilio)中[15]，我國最早于2011年在新疆維吾爾自治區(qū)的森林革蜱(D.silvarum)中首次檢測到SFGR病原[16]，與之前報道結(jié)果一致，拉歐蒂立克次體主要由革蜱攜帶傳播[17].埃氏立克次體于1997年在莫斯科的邊緣璃眼蜱(Hy.marginatummarginatum)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)[18]，我國首次在伊寧縣羊體表圖蘭扇頭蜱(R.turanicus)和察布查爾縣刻點血蜱(Haemaphysalispunctata)中發(fā)現(xiàn)其核酸的存在[19].璃眼蜱是埃氏立克次體的主要宿主，本研究從麻點璃眼蜱(Hy.rufipes)中檢測到埃氏立克次體，也進一步證明了這一觀點.與首次報道相比，本次從尼勒克縣和鞏留縣檢測出埃氏立克次體，說明該病原在新疆有擴展趨勢，病原出現(xiàn)的地方增多.斯洛伐克立克次體主要分布于歐洲大部分國家，主要在革蜱屬中檢出；有研究指出斯洛伐克立克次體有可能在家畜中進行垂直傳播[20]，在許多國家有人感染該病的報道[21-22]，婦女和12歲以下兒童為主要感染對象；而亞洲對該病的報道較少，我國首次報道該病于2012年，由田占成等在新疆新源縣森林革蜱中發(fā)現(xiàn)[23].

圖6 斑點熱立克次體核酸序列相似性比較Figure 6 The Comparison of nucleic acid sequence similarity of Spotted fever group rickettsia nucleic acid sequences

斑點熱立克次體可以引起人的嚴(yán)重疾病，對其進行流行病學(xué)研究具有重要意義[24].在以往的有關(guān)SFGR病原調(diào)查的報道中，全部為某一地區(qū)或某1個種的單一調(diào)查和報道.本研究較之前報道相比，采樣范圍廣泛，涉及到的蜱蟲種類多，檢出的SFGR病原豐富，采樣地均為邊境地區(qū)，與3個國家接壤，具有一定的代表性.通過本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SFGR病原在新疆地區(qū)廣泛流行，各種生境均有分布，而且存在兩種病原的交叉感染；這一現(xiàn)象大大增加了病原的檢測和預(yù)防難度，加之新疆是我國重要的貿(mào)易口岸，與多個國家相鄰，加劇了外來病原的入侵的可能.通過本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，較之前的報道相比，SFGR病原的種類和分布范圍正在逐步擴大，有蔓延全境的趨勢.依據(jù)本次調(diào)查結(jié)果，應(yīng)該引起相關(guān)部門對本病的高度重視，做好SFGR病原的防控和預(yù)防措施，以防止疫情的進一步擴散與蔓延.