白映祿，薛玉麗，常蕓，尚素琴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

近年來隨著甘肅省玉米、果樹等農(nóng)作物種植面積的增加，葉螨逐漸成為了阻礙甘肅省農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[1].葉螨主要通過取食植物葉肉組織的細(xì)胞及細(xì)胞液，使植物的生理狀態(tài)惡化，葉片掉落，甚至引起植株死亡，從而降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量[2].鑒于葉螨在甘肅省農(nóng)作物上的發(fā)生與危害程度，對其種群系統(tǒng)關(guān)系的研究工作勢在必行.

由于葉螨體型微小，物種間形態(tài)學(xué)特征相似，往往給種類鑒定造成困難.rDNA ITS1序列是位于18S與5.8S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄1區(qū)，進(jìn)化速率較慢，有高度保守性，是研究近緣種、復(fù)合種及種內(nèi)生物型間親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育的良好分子標(biāo)記[3-4].目前基于ITS序列來研究害螨種群系統(tǒng)關(guān)系方面的研究已有報(bào)道.Ben-David和Navajas等[5-7]利用ITS2序列間的差異對植綏螨科(Phytoseiidae)和葉螨科(Tetranychidae)物種進(jìn)行鑒定，甚至是相近物種、復(fù)雜物種和地理種群的鑒定；Navajas等[8]對來自地中海盆地的二斑葉螨種群核糖體ITS2序列變異進(jìn)行了調(diào)查，評估了寄主植物的作用和遺傳分化過程中的地理距離.然而利用ITS對甘肅省葉螨鑒定的報(bào)道并不多，只有少數(shù)的關(guān)于其遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生的研究[9].因此，本試驗(yàn)依據(jù)中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志(二十三冊，螨目)[3]所提出的葉螨形態(tài)特征對葉螨科2個(gè)屬6個(gè)種27個(gè)種群進(jìn)行了形態(tài)鑒定，對其rDNA ITS1序列進(jìn)行了測序和研究，旨在利用rDNA ITS1對葉螨進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，為葉螨的種類鑒定和系統(tǒng)關(guān)系提供相應(yīng)的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：供試葉螨屬物種采集于甘肅省4個(gè)地區(qū)不同寄主，采集地和寄主植物見表1.將采集到的葉螨使用“葉碟法”飼養(yǎng)在室內(nèi)，飼養(yǎng)條件為(25±1)℃，L∶D=16∶8 h.保存在無水乙醇中，用于后續(xù)試驗(yàn).

表1 甘肅葉螨采樣信息

供試藥劑：STE緩沖液(含100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，蛋白酶K(10 mg/mL).

1.2 方法

1.2.1 葉螨總DNA提取 DNA的提取參考GOMI Koh等的方法[10].具體操作如下：向已編號的1.5 mL離心管內(nèi)加入25 μL STE緩沖液，在體視顯微鏡下挑取成活且長勢一致的單頭雌成螨(保存于無水乙醇中的螨需在無菌水中清洗，歷時(shí)5 s，重復(fù)3次)放入離心管內(nèi)，立即研磨，研磨后將離心管置于冰上，向離心管內(nèi)加入2 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，1 000 r/min離心10 s后，于37 ℃下孵育30 min，95 ℃初始變性5 min，于-20 ℃條件下保存.

1.2.2 葉螨ITS1序列PCR擴(kuò)增和測序 使用一對特異性引物[11]從葉螨rDNA的5.8S和28S之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)中擴(kuò)增出一段長度為650 bp左右的片段.

上游引物為：5′-ATATGCTTAAATTCAGC GGG-3′；下游引物為：5′-GGGTCGATGAAGAA CGCAGC -3′.

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板2 μL，ddH2O 30.6 μL，10倍buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)5 μL， dNTPs(各種濃度均為10 mmol/L)4 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μm)0.4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL.

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，92 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min，4 ℃保存.取每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物5～9 μL，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，后將PCR產(chǎn)物送去西安擎科澤西生物有限公司測序.

1.3 數(shù)據(jù)比對及分析

將測序所得的葉螨rDNA ITS1序列先提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，然后利用“BLAST”工具(NCBI網(wǎng)站)進(jìn)行序列分析、DNA序列檢索，用GenDoc軟件進(jìn)行序列同源性比較，用BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯，用(Clustal X)軟件進(jìn)行序列比對，DAMBE用于核苷酸序列的飽和度分析，比對結(jié)果輸入MEGA 6.0軟件，采用距離法計(jì)算各樣品間的遺傳距離，并基于Kimura-2 Parameter模型，用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自展1 000次檢驗(yàn)獲得系統(tǒng)樹分支的置信度[12-13].

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS1的序列差異及飽和度分析

本試驗(yàn)研究了來自葉螨科2屬6種27個(gè)種群的rDNA ITS1長度為596～688 bp的片段.保守位點(diǎn)390個(gè)，變異位點(diǎn)300個(gè)，簡約信息位點(diǎn)294個(gè)，堿基A、T、C、G的平均含量分別為32.5%、31.0%、18.6%、17.9%.A+T含量(63.5%)明顯高于C+G含量(36.5%)，有明顯的A/T偏倚性.核苷酸多樣性為0.128.共檢測出9個(gè)單倍型，單倍型指數(shù)為0.775.各單倍型在各地區(qū)種群中的分布見表2.9個(gè)單倍型中，H1包含的個(gè)體最多，為主單倍型，共出現(xiàn)12次，占樣本總數(shù)的44.4%，分布在5個(gè)地區(qū).其次為H2，出現(xiàn)5次，占樣本總數(shù)的18.5%，分布在2個(gè)地區(qū).H4、H5、H7出現(xiàn)3次.其余單倍型各出現(xiàn)1次.

由表3可知，葉螨屬內(nèi)二斑葉螨和神澤氏葉螨核苷酸差異僅為0.010，柑橘全爪螨和山楂葉螨核苷酸差異為0.409.由此可看出屬間遺傳距離遠(yuǎn)大于種間遺傳距離.葉螨屬內(nèi)平均遺傳距離為0.124.

將rDNA ITS1序列中所有位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換(S)、顛換(V)同Tamura-Nei(TN93)距離進(jìn)行比較來驗(yàn)證葉螨ITS1序列中是否存在突變飽和現(xiàn)象.rDNA ITS1序列全部位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換和顛換與相應(yīng)的序列差異的散點(diǎn)圖(圖1)顯示，轉(zhuǎn)換顛換沒有發(fā)生突變飽和，所得序列可以用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析.

表2 各單倍型在群體中的分布

表3 葉螨ITS1序列的種間遺傳距離

1：柑橘全爪螨；2：朱砂葉螨；3.截形葉螨；4：二斑葉螨；5：山楂葉螨；6：神澤氏葉螨.

1：Pa.citri；2：T.cinnabarinus；3：T.truncatus；4：T.urticae；5：T.viennensis；6：T.kanzawai.

2.2 基于ITS1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究所得到的27個(gè)葉螨的ITS1序列已提交到GenBank(登錄號MK560213-MK560239).引用GenBank中登錄號為GQ141938和GQ141944序列作為外群，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建甘肅葉螨不同種群的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對各分支的置信度自展法進(jìn)行1 000次檢驗(yàn).如圖2所示，土耳其斯坦葉螨(GQ141938)和酢漿草巖螨(GQ141944)作為外群，最先被分離出來.兩個(gè)葉螨的種群都以較高的置信度成一個(gè)進(jìn)化分支，柑橘全爪螨獨(dú)立聚為一支分支.不同物種之間的界限清晰.朱砂葉螨T.cinnabarinus和二斑葉螨T.urticae種群聚合在一起，但神澤氏葉螨T.kanzawai的分類歸屬并未得到很好地解決.

圖1 甘肅葉螨不同種群ITS1序列堿基替換飽和性分析Figure 1 Saturability analysis of base substituttion of spider mite genus Tetranychus based on ITS1 sequences in Gansu

3 討論

葉螨屬的ITS序列具有物種內(nèi)差異小，物種間差異大的特性[14]，為葉螨屬物種的鑒定提供了可靠的分子標(biāo)記.其中二斑葉螨的多態(tài)型與其廣泛分布、多食性均有著密切關(guān)系，給鑒定造成很大困擾[15-16].1971年國際動(dòng)物命名委員會建議將紅色型定為朱砂葉螨(T.cinnabarinus)[7]，但是國內(nèi)外學(xué)者對這兩個(gè)物種持有不同的觀點(diǎn).匡海源等[18]對二者的形態(tài)特征(包括體色、足I脛節(jié)剛毛以及陽具形狀)進(jìn)行了對比，測定了兩個(gè)種的非越冬型雌成螨的過冷卻點(diǎn)，結(jié)果都存在差異，而且雜交試驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了它們各為獨(dú)立的種.但隨著研究的逐漸深入和分子技術(shù)在物種鑒定上的應(yīng)用，Navajas、Ueckermann等[5,19]比較了兩種葉螨的rDNA ITS2和mtDNA COI序列，并采用構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫等分子生物學(xué)手段，研究發(fā)現(xiàn)朱砂葉螨和二斑葉螨進(jìn)化同源性很高，認(rèn)為二者存在同物異名現(xiàn)象，應(yīng)該分別為紅色型和綠色型，提出二者屬于同一個(gè)種.本研究分別提取了2種色型葉螨的ITS1序列，經(jīng)過計(jì)算兩者間遺傳距離為0.003，在系統(tǒng)發(fā)育樹中朱砂葉螨與二斑葉螨聚合在一起，該結(jié)果與李國慶等[20]報(bào)道二斑葉螨和朱砂葉螨遺傳距離為0，在系統(tǒng)發(fā)育樹中二者同在一個(gè)分支上的結(jié)果類似，說明二斑葉螨與朱砂葉螨為同種不同色型.

DNA條形碼技術(shù)通常是利用線粒體5′端序列將物種鑒定到種水平的一種方法.本研究通過使用ITS1分子條形碼對葉螨屬種內(nèi)差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，6 種葉螨種間差異均大于2%，種內(nèi)的差異性小于2%，該結(jié)果與Hebert等[21]報(bào)道98%的物種種間核苷酸差異大于2%，種內(nèi)差異小于2%的結(jié)果相同.本試驗(yàn)中截形葉螨和神澤氏葉螨之間核苷酸差異為0，二斑葉螨與神澤氏葉螨以及截形葉螨與二斑葉螨之間核苷酸差異均為0.010，表明這3 個(gè)物種間的ITS1片段都具有高度的保守性，但是該結(jié)果與Navajas等[22]報(bào)道土耳其斯坦葉螨和截形葉螨之間核苷酸差異小于0.5%的結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)橐韵略颍?1)不同種類的葉螨之間核苷酸距離存在差異性；(2)不同地域環(huán)境因素對葉螨形態(tài)及遺傳特性的影響.核糖體RNA第一轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)具有高度保守性，進(jìn)化速率較慢，僅通過序列間核苷酸微小的差異難以對物種做出正確的鑒定，因此在進(jìn)行有關(guān)葉螨的分類研究時(shí)，建議分子條形碼鑒定應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行.

崔玉楠[23]利用ITS作為分子標(biāo)記對中國8個(gè)葉螨屬物種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，種間差異大于種內(nèi)差異，系統(tǒng)發(fā)育樹中同物種的不同個(gè)體都聚合成一簇，該結(jié)果與本研究結(jié)果一致.但是本研究中神澤氏葉螨的系統(tǒng)關(guān)系并未有充分的明確，可能是因?yàn)橐韵略颍?1)采集到的神澤氏葉螨樣品有限，物種豐富度不夠；(2)其體內(nèi)寄生有Wolbachia、Cardinium等共生菌，從而引起細(xì)胞質(zhì)不親和現(xiàn)象，影響其種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性[24].但不可否認(rèn)的是rDNA ITS1是一種有效的DNA分子標(biāo)記，適用于解決葉螨科屬種的系統(tǒng)發(fā)生地位，同時(shí)它可以作為線粒體分子標(biāo)記的一個(gè)重要輔助手段，為葉螨DNA條形碼的研究提供參考.同時(shí)，本試驗(yàn)也研究了來自葉螨科2個(gè)屬6種27個(gè)種群的rDNA ITS1長度為596～688 bp的片段，其保守位點(diǎn)390個(gè)，變異位點(diǎn)300個(gè)，簡約信息位點(diǎn)294個(gè)，堿基A、T、C、G平均含量為32.5%，31.0%，18.6%，17.9%.A+T含量(63.5%)明顯高于C+G含量(36.5%)，有明顯的A/T偏倚性.核苷酸多樣性為0.128.共檢測出9個(gè)單倍型，單倍型指數(shù)為0.775.該試驗(yàn)結(jié)果與楊順義等[13]報(bào)道在34個(gè)截形葉螨地理種群中共獲得518條mtDNACOI基因片段，測定片段長度為402 bp，T， C，A和G 4個(gè)堿基平均含量分別為43.2%、10.5%、32.2%和14.0%，A+T含量為(75.4%)明顯高于C+G含量(24.6%)，有明顯的A/T偏倚性，核酸多樣性指數(shù)為0.032 8，共檢出12個(gè)單倍型，單倍型指數(shù)為0.800 4的結(jié)果相似，說明甘肅省葉螨群體內(nèi)部遺傳多樣性豐富.

近年來，隨著甘肅省玉米和果樹等作物的種植面積增加，本研究中的6種葉螨已成為主要的為害螨品種，嚴(yán)重阻礙了甘肅省農(nóng)業(yè)發(fā)展.本研究通過基于rDNA ITS1序列的甘肅省葉螨屬Tetranychus和全爪螨屬Panonychus種群的系統(tǒng)關(guān)系研究，以期為明確甘肅不同葉螨種群間的系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化關(guān)系提供一定的遺傳學(xué)證據(jù)，進(jìn)而為該螨的區(qū)域性發(fā)生規(guī)律研究和防治策略制定等提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論依據(jù).目前本研究僅限于對采自甘肅的不同地理種群及不同寄主的共27個(gè)葉螨種群的rDNA ITS1序列和不同葉螨種內(nèi)、種間的親緣性差異等進(jìn)行比較分析，但是有關(guān)不同葉螨基于基因組水平上的差異性分析等仍需進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

本研究基于rDNA ITS1序列探討了甘肅省葉螨屬和全爪螨屬種群的系統(tǒng)關(guān)系，結(jié)論可知，系統(tǒng)發(fā)育樹中朱砂葉螨與二斑葉螨聚合在一起，支持二斑葉螨與朱砂葉螨為同種不同色型的觀點(diǎn)；6 種葉螨種間差異均大于2%，種內(nèi)差異小于2%；截形葉螨和神澤氏葉螨之間核苷酸差異為 0，二斑葉螨與神澤氏葉螨以及截形葉螨與二斑葉螨之間核苷酸差異均為0.010，表明 3 個(gè)物種間的ITS1片段都具有高度保守性；明確了葉螨屬和全爪螨屬的系統(tǒng)發(fā)生地位，山楂葉螨與其他葉螨屬物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn).