丁訖　李源棟　劉秀明　夏建軍　趙軼　李娟　楊義　段焰青

摘要：以普洱茶茶梗為原料，基于煙草中分離獲得3株菌株發(fā)酵制備煙用香料。采用同時蒸餾萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對茶梗發(fā)酵香料進行提取分析，通過GC/MS成分分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵物中苯乙醇、植醇、棕櫚酸等部分香氣成分增加，并采用發(fā)酵物對卷煙進行加香評吸，發(fā)現(xiàn)對卷煙抽吸感官有著明顯的提升。通過煙草分離出來的菌株能對茶梗進行很好的產(chǎn)香并改善卷煙感官品質(zhì)，該文可為進一步研究發(fā)酵香料提供理論參考。

關(guān)鍵詞：普洱茶茶梗;微生物發(fā)酵;煙用香料;感官評價

中圖分類號：TS426 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）08-0067-08

0 引言

普洱茶是我國特產(chǎn)茶，主要產(chǎn)于云南勐海、勛臘、普洱市、耿馬、滄源、雙江、臨滄、元江、景東、大理等地。普洱茶香氣獨特，并具有減肥、降血糖、降血脂、防癌、抗氧化等保健功效[1-4]。普洱茶根據(jù)不同加工工藝分為生茶和熟茶，握堆發(fā)酵利用其中酶促、微生物和濕熱作用使普洱茶發(fā)生一系列物理化學(xué)變化，改變茶主要成分產(chǎn)生不同特色香味[5-8]。據(jù)報道，茶葉中許多香氣成分與煙草中的相同或相似;因此，本文通過從煙葉中分離出的菌株對茶葉進行發(fā)酵試驗，將茶葉提取液作為卷煙添加劑，可與煙香諧調(diào)，彌補煙香，增加卷煙煙氣香氣量，提高香氣質(zhì)，改善抽吸品質(zhì)，并在一定程度上降低卷煙煙氣有害成分[9-11]。茶梗是茶加工過程產(chǎn)生的大量茶廢棄物，并未得到充分利用[10]，目前利用微生物發(fā)酵技術(shù)開發(fā)煙用香精香料在煙草行業(yè)已有較為廣泛應(yīng)用，本文擬通過普洱茶茶梗與煙葉中微生物進行發(fā)酵制備香料，采用同時蒸餾萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（SDE-GC/MS）對不同微生物發(fā)酵香料成分進行對比分析，并進行卷煙添加實驗，評價其應(yīng)用效果，實現(xiàn)對普洱茶茶梗綜合利用，變廢為寶。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

普洱茶茶梗，購于市場;枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis（Van3，保藏號：CGMCC No.4091），短小芽孢桿菌Bacillus pumilus（Van35，保藏號：CGMCCNo.3411），長孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus（OF-08，保藏號：CGMCC No.6645），3種菌株均收藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;二氯甲烷，GR級，由百靈威科技有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀+自動進樣器（美國安捷倫科技有限公司）;萬分之一電子天平（瑞士Mettler Tloede公司）;10mL移液器（德國Eppendorf公司）;粉碎機（上海比朗制造有限公司）;同時蒸餾提取裝置;Milli-Q型超純水機（美國Milli-pore公司）;BUCHI R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）等。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵處理

選取800g普洱茶茶梗放入粉碎機粉碎，將樣品粉末分成4份，每份200g，放入4個2L的錐形瓶中，加入1L的超純水，用密封膜密封放入滅菌鍋，在121℃的條件下滅菌0.5h。其中一個錐形瓶為空白，另外3個分別接種3種不同的菌株。將V35（短小芽孢桿菌）、V3（枯草芽孢桿菌）、OF-08（長孢洛德酵母）菌種活化培養(yǎng)成種子液（OD600為18～2.0）并在無菌實驗臺進行接種，接種量按質(zhì)量比為2%，150r/min、37℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5d，過濾獲得到普洱茶茶梗發(fā)酵液[11-13]。

1.2.2 發(fā)酵香料制備

將普洱茶茶梗發(fā)酵液中加入400mL體積分數(shù)為80%的乙醇進行加熱回流提取2h后過濾，重復(fù)3次，將3次濾液合并，靜置1d取上清液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃蒸餾除去乙醇，留下所得物再用200mL的95%乙醇靜置1d，取上清液并在60℃下減壓濃縮，得到發(fā)酵香料[14]。

1.2.3 同時蒸餾萃取

將普洱茶茶梗發(fā)酵香料50g加入同時蒸餾萃取裝置一端的1L圓底燒瓶中，加入500mL超純水、1mL內(nèi)標溶液（質(zhì)量濃度為50μg/mL萘溶液）及少許沸石，采用電熱套在110℃下進行加熱;裝置另一側(cè)是盛有50mL二氯甲烷的圓底燒瓶，在50℃下水浴加熱，同時蒸餾萃取4h。將二氯甲烷溶液收集并用無水硫酸鈉干燥12h，除去水分后過濾，將濾液減壓濃縮至1mL，待GC-MS分析[14]。

1.2.4 色譜質(zhì)譜分析方法

色譜條件。DB-5M毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），載氣為氦氣（純度為99.99%），流量：1.0mL/min。升溫程序：初始溫度50℃，保持2min;以3℃/min的速率升溫至180℃;再以10℃/min的速率升溫至230℃，保持10min。進樣口溫度：250℃，進樣量：1.0μL，分流比：20：1，溶劑延遲6min。

質(zhì)譜條件。離子源：電轟擊電離（EI）源;離子源溫度：230℃;四極桿溫度：150℃;電離能量：70eV;傳輸線溫度：280℃;掃描范圍（m/z）：40～450，質(zhì)譜檢索圖庫：NIST譜庫。

1.2.5 定量方法

采用GC-MS測定3種菌株發(fā)酵普洱茶茶梗香料中揮發(fā)性化學(xué)成分，通過Nist11圖庫進行檢索確定其組分，扣除柱流失和溶劑殘留，利用內(nèi)標法確定各組分的相對含量。半定量計算目標物相對含量。方法如下：使用二氯甲烷作為溶劑配制50μg/mL萘溶液作為內(nèi)標液[15]。分別稱量50g不同菌株發(fā)酵香料同時蒸餾萃取，加入1mL內(nèi)標液，測得內(nèi)標物和目標物的峰面積，通過下式計算得到目標物相對含量[14]：

C_目標=C_{內(nèi)標×}A_{內(nèi)標/50×}A_內(nèi)標

式中：C_目標——目標物質(zhì)量濃度，μg/g;

C_內(nèi)標——內(nèi)標物濃度，mg/L;

A_內(nèi)標——內(nèi)標物峰面積;

A_目標——目標物峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶茶梗發(fā)酵香料成分分析

3種不同的菌株發(fā)酵及空白對照，通過GC-MS檢測得出總離子流色譜圖見圖1～圖4，通過計算分析得出各組分含量，結(jié)果如表1所示。

從表1可知，未發(fā)酵茶梗香料中鑒定出42種化合物，包括醇類11種、醛類4種、酉旨類5種、酚類5種、酮類6種、酸類3種、其他化合物8種，主要成分為糠醇（43.03μg/g），植醇（40.29μg/g），芳樟醇（37.24μg/g），α-松油醇（27.67μg/g），棕櫚酸（20.64μg/g），香葉醇（17.77μg/g），苯乙醛（11.02μg/g），橙花醇（10.54μg/g）等;V35發(fā)酵茶梗香料中鑒定出52種化合物，包括烯烴類2種、醇類16種、醛類4種、酯類4種、酚類5種、酮類8種、酸類5種、其他化合物8種，主要成分為植醇（61.30μg/g），棕櫚酸（56.35μg/g），芳樟醇（54.01μg/g），糠醇（53.97wg/g），α-松油醇（42.69μg/g），香葉醇（27.04μg/g），苯乙醛（15.17μg/g），橙花醇（13.78μg/g）等;V3發(fā)酵茶梗香料中鑒定出化合物60種，包括醇類15種、醛類4種、酯類5種、酚類6種、酮類10種、酸類10種、其他化合物10種，主要成分為棕櫚酸（89.38μg/g），植醇（80.94μg/g），糠醇（77.31μg/g），芳樟醇（62.91μg/g），α-松油醇（48.10μg/g），香葉醇（33.43μg/g），咖啡因（23.40μg/g），橙花醇（16.80μg/g）等;OF-08發(fā)酵茶梗香料中鑒定出48種化合物，包括烯烴類1種、醇類12種、醛類5種、酯類8種、酚類5種、酮類5種、酸類5種、醚類1種、其他化合物6種，主要成分為苯乙醇（536.95μg/g），植醇（69.82μg/g），芳樟醇（54.99μg/g），α-松油醇（42.50μg/g），棕擱酸（40.17μg/g），咖啡因（19.60μg/g），橙花醇（17.09μg/g），2，3-二氫苯并呋喃為（13.88μg/g）等。

通過采用不同菌株對普洱茶茶梗進行發(fā)酵處理，相比于空白，不同的菌株發(fā)酵后產(chǎn)生的香味成分種類和數(shù)量都存在一定差異，其特征主要香味成分含量存在明顯變化，導(dǎo)致不同的香氣及效果，給卷煙加香產(chǎn)生不同評吸感受。其中植醇具有細膩的花香和膏香，其含量增加52.14%～100.89%;棕櫚酸具有淡淡的蠟味、增加口感，其含量增加94.62%～333.04%;芳樟醇具有花香、木香、微弱的柑橘香及花甜香味，其含量增加45.03%～68.93%;糠醇具有微弱的發(fā)酵香、焦糖香、奶油味和焦甜味，其含量增加25.42%～79.66%;α-松油醇具有微弱的發(fā)酵香、焦糖香、奶油味和焦甜味，其含量增加53.59%～73.83%;香葉醇具有甜香、玫瑰花香、水果味，其含量增加-69.61%～88-12%;苯乙醇具有玫瑰花香及花香味，其含量增加36.55%～1256.39%。

2.2 添加普洱茶茶梗發(fā)酵香料卷煙感官評吸結(jié)果

將三種菌株發(fā)酵香料分別取0.1g，用無菌水稀釋40倍，均勻噴灑在40g煙絲上;用密封袋密封后在80℃烘箱中放置30min;以空白煙絲作為對照，將處理組和對照組的煙絲在溫度22℃和相對濕度60%的恒溫恒濕箱中平衡24h;按常規(guī)方法卷成煙支并隨機編號后，由專業(yè)評吸人員進行感官評吸[16]。參照GB5606.4-2005《卷煙第四部分：感官技術(shù)要求》[17]對煙支樣品進行感官評價（見表2）。評吸結(jié)果表明：相比對照，普洱茶茶梗發(fā)酵香料具有改善煙香、余味，增加甜潤感、降低刺激，吸味更加柔和效果，明顯提升了卷煙感官抽吸品質(zhì)。

3 結(jié)束語

本文采用從煙葉中分離出來的3種菌株對普洱茶茶梗進行發(fā)酵制備香料，結(jié)合SDE-GCIMS對普洱茶茶梗發(fā)酵香料成分進行對比分析，其中從V35（短小芽孢桿菌）、V3淞草芽孢桿菌）、OF-08（長孢洛德酵母）普洱茶茶梗發(fā)酵香料中分別鑒定出52種、60種和48種化合物，不同菌株發(fā)酵普洱茶茶梗香料中成分含量以及種類有著明顯差異。發(fā)酵后香氣成分相對于未發(fā)酵有所增加，最為突出的是OF-08發(fā)酵物中苯乙醇相對于未發(fā)酵增加了1256.39%，試驗證明OF-08（長孢洛德酵母）能發(fā)酵產(chǎn)生大量的苯乙醇。同時將3種不同發(fā)酵香料進行卷煙評吸，相比對照，普洱茶茶梗發(fā)酵香料具有改善煙香、余味，增加甜潤感、降低刺激，使吸味更加柔和的效果，且不同菌株發(fā)酵普洱茶茶梗香料對卷煙抽吸品質(zhì)改善效果不一樣。本研究采用煙葉中分離出來的微生物對普洱茶茶梗進行發(fā)酵，產(chǎn)生了大量的致香物質(zhì)，能很好的改善卷煙的抽吸感，并不會破壞原有的和諧及香氣，且成本較低，安全性高，該方法在煙用香精香料中具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

參考文獻

[1]MOK P，CHANG R C C，MINGFU W，et al.A review on thelaboratory investigations and epidemiological studies of blackand Puerh tea[J].ACS Symposium Series，2008，987：144-159.

[2]HUANG Q F，CHEN S，CHEN H，et al.Studies on thebioactivity of aqueous extract of Pu-erh tea and its fractions：invitro antioxidant activity and a-glycosidese inhibitoryproperty，and their effect on postprandial hyperglycemia indiabetic mice[J].Food and Chemical Toxicology，2013，53（3）：75-83.

[3]顏振敏，吳艷兵，馮俊旗，等.普洱茶揮發(fā)性成分的GC-MS分析[J].光譜實驗室，2012，29（4）：2235-2237.

[4]周紅杰，郭紅芳，曾燕妮，等.陳香普洱茶品質(zhì)特點分析[J].茶葉，2001，27（3）：31-34.

[5]龔淑英，周樹紅.普洱茶貯藏過程中主要化學(xué)成分含量及感官品質(zhì)變化的研究[J].茶葉科學(xué)，2002，22（1）：51-56.

[6]任洪濤，周斌，夏凱國，等.不同發(fā)酵程度普洱茶香氣成分的比較分析[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（11）：23-26.

[7]陳保，徐明發(fā)，姜東華，等.不同普洱茶原料握堆發(fā)酵過程中香氣成分的變化研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（2）：284-293.

[8]陳保，滿紅平，姜東華，等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分析普洱茶握堆發(fā)酵過程中的香氣成分變化[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2017，8（6）：2191-2198.

[9]倪躍新.鐵觀音茶葉揮發(fā)性致香物的制備及其在卷煙加香中的應(yīng)用[J].香料香精化妝品，2012（3）：4-6.

[10]張維麟，李依蔓.茶葉渣對廢水中Crb+和MnO，一的吸附效果研究[J].時代農(nóng)機，2013，40（3）：220-223.

[11]杜雷，趙高嶺，席宇，等.煙梗廢料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蘇云金芽孢桿菌的適宜條件篩選[J].煙草科技，2011，46（12）：75-78.

[12]李仙，董偉，段繼銘，等.羊肚菌發(fā)酵煙草多糖及其在卷煙中的初步應(yīng)用[J].中國煙草科學(xué)，2011，32（3）：36-40.

[13]李成斌，李仙，劉煜宇，等.葡萄發(fā)酵煙用香料的制備及揮發(fā)性成分分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2012，31（8）：891-895.

[14]趙升逵，李源棟，王紅霞，等.SDE/GC-MS分析烘烤葵花殼的揮發(fā)性成分[J].中國食品添加劑，2016（8）：177-184.

[15]蔣美紅，包崇彥，念小魁，等.紅茶煙用香料的制備、分析及應(yīng)用[J].茶葉科學(xué)，2007，27（2）：117-119.

[16]李勇，王猛，陳劍明，等.出芽短梗霉OF-O1菌株的篩選及其在煙草香料中的應(yīng)用[J].輕工學(xué)報，2017，32（4）：49-57.

[17]中國國家標準化管理委員會.卷煙第四部分：感官技術(shù)要求：GB5606.4-2005[S].北京：中國標準出版社，2005.

（編輯：莫婕）